受精卵原核显微注射 [实验目的] 1 了解受精卵显微注射的基本原理及动物转基因制作过程 2 掌握受精卵显微注射基本技术 [实验原理] 显微注射技术是利用显微操作系统和显微注射技术将外源目的基因直接注入到受精卵的原核中，使外源基因整合到受体细胞的基因组内，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体动物的子宫内发育，从而获得转基因动物。它是目前基因转移效率较好的一种基因转移方法，可直接用不含有原核载体DNA片段的外源基因进行转移；外源基因的长度不受限制,可达100kb；实验周期相对比较短。由于显微注射技术直接对基因进行操作，整合率较高，因而是目前建立转基因动物极为重要的方法。 [仪器、材料和试剂] （一）仪器和耗材： 1.PN-30拉针仪（Narishige） 2. OLYMPUS SZX7实体镜 3. EG-400磨针仪（Narishige） 4. MF-900 锻针仪（Narishige） 5. OLYMPUS IX71倒置显微镜 6. Narishige显微操作系统 7. JM-250电泳仪（大连捷迈） 8 眼科手术器械及显微手术器械（ROBOZ） 9. 毛细玻璃管G-100，GC-1（Narishige） 10.细胞培养箱（Heraeus）、超净工作台、塑料平皿等。 （二）试剂 1.目的基因制备相关试剂 1.1 分子克隆相关试剂：TaqDNA聚合酶，DNA 连接酶，各种内切酶等 1.2受精卵制备相关试剂：孕马血清（PMSG），人绒毛膜促性腺激素（HCG），透明质酸酶等 1.3 转基因载体制备相关试剂 1.3.1 细菌培养基 （1）LB培养基（1L）： NaCl 10g， 酵母提取物5g，蛋白胨10g ，pH7.0 （2）2×YT培养基(1L)：NaCl 5g， 酵母提取物10g，蛋白胨16g 1.3. 2 质粒提取溶液配制 溶液Ⅰ：L-葡萄糖50mM，Tris-Cl(pH8.0) 25 mM，EDTA(pH8.0) 10mM，121.5℃ 高压灭菌20min。 溶液Ⅱ（100ml）：1N NaOH 20ul，10%SDS 10ml，水90ml现用现配。 溶液Ⅲ（100ml）：5mM乙酸甲60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml。 1.4．胚胎培养及注射缓冲液： 胚胎培养液M16(5.533g NaCl, 0.356g KCl, 0.252g CaCl2·2H2O, 0.162g KH2PO4, 0.293g MgSO4·7H2O, 2.101gNaHCO3, 2.610g Sodium lactate, 0.036g Sodium pyruvate, 1.00g Glucose, 4.00g BSA, 0.06g Penicillin G · potassium salt, 0.05g Streptomycin sulfate, 0.01g Phenol Red, 用三蒸水定容至1L)，也可以用商品化的M16培养基。 受精卵操作培养液M2 (5.533g NaCl, 0.356g KCl, 0.252g CaCl2·2H2O, 0.162g KH2PO4, 0.293g MgSO4·7H2O,0.349g NaHCO3, 4.969g HEPES, 2.610g Sodium lactate, 0.036g Sodium pyruvate, 1.00g Glucose, 4.00g BSA, 0.06g Penicillin G · potassium salt, 0.05g Streptomycin sulfate, 0.01g Phenol Red, 用三蒸水定容至1L)，也可以用商品化的M2培养基。 注射缓冲液（5-10mM tris-HCl pH7.4，0.1-0.25mM EDTA） 1.5 转基因鉴定相关试剂 （1）核酸提取组织裂解液：Tris·Cl (pH7.4) 25mM，EDTA 100mM，SDS 0.5%， protease K 100ug/ml. （3）PCR鉴定试剂：TaqDNA聚合酶，dNTP，引物等 [方法与步骤] （一）外源基因的制备及纯化 相对其他转基因方法来说，用于显微注射的载体构建简单，最典型的载体主要包括：载体在细菌中扩增的相关元件（复制原点，筛选抗性基因等）；真核表达相关元件（启动子、增强子、目的基因、Poly A等）（如下图） 为了增强目的基因表达，可在目的基因中引入内含子或者直接用含内含子的基因组序列。为了提高目的基因整合的几率，在注射前需用限制性内切酶将载体线性化并尽量去掉原核序列。另外，注射的用DNA的纯度要求比较高，不能有微小颗粒和提取过程中有害杂质，否则会对细胞造成毒害，一般要求用cscl梯度离心纯化。所用的TE的浓度比一般溶解DNA所的TE有所区别，该TE由 5－10mmol Tris(pH7.4)和0.1-0.25mM EDTA组成。 注射用的DNA的浓度一般为1—3ug/ml，浓度高有助于提高目的基因的整 （1）根据所用的转基因载体特点，选择特定的限制性核酸内切酶将包含完整真核表达元件及目的基因的片段切下，进行琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕在紫外灯下将含目的转基因的片段的琼脂糖凝胶切下，操作时尽可能减少凝胶的体积。将所得凝胶块放入透析袋中，电泳2-3小时使凝胶中的DNA片段完全游离出凝胶并粘贴到透析袋壁上。去除透析袋中的凝胶块，将贴有DNA片段的透析袋放入到新鲜的电泳液中再电泳3-5分钟，收集袋中含DNA片段溶液。 （2）用Tris-HCl饱和酚抽提DNA溶液数次，以去除琼脂糖、蛋白等杂质，然后用乙醚抽提3次，留下层液体。 （3）用2倍体积无水乙醇沉淀2-3次， 70%乙醇洗2-3次，用2.4ml Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA溶解沉淀（至少需含5-10ug DNA），然后加入3g超纯CsCl，待其充分溶解后，检测其密度是否是1.70±0.01g/ml，如果有差异，可用CsCl或Tris/ EDTA缓冲液进行调整。 （4）将调整好密度的溶液转移到1.3cm×5.0cm超速离心管中，然后加几滴石蜡油封管，40000rpm室温离心48h（Bekman SW50.1转子），离心完毕，用针头在离心管底部扎孔收集管底约0.2ml组份，另外抽取离心管中部组份，用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定是否含有DNA，最后将含DNA的组份与离心管底部组份合并。 （5） 收集到的DNA溶液装入透析袋，于4℃在大体积的注射缓冲液中透析48h，期间换透析液5-7次。 （6） 将充分透析的DNA溶液经0.2um滤膜过滤除菌，电泳定量其浓度。按20ul/管分装冻存待用。 （二）实验动物的繁育 通常用于制作转基因小鼠的实验动物主要有近交系C57BL/6J，CBA/J、C3H/HeJ、DBA/2J、SJL等以及远源杂交系CD1、KM等。制作过程中需要高质量的供卵鼠、可育雄鼠、不育雄鼠以及假孕母鼠（代孕鼠），这些动物需要饲养在湿度（50％-70%）和温度（19℃-22℃）均可控且具有过滤系统的环境中，因为光照时间对小鼠的性周期影响较大，繁育环境明暗周期一般控制为12h，为早6:00-晚6:00。 1、受精卵供应鼠 可选用4到6周龄的C57BL/6J× CBA/J、C57BL/6J×SJL、 C57BL/6J×C3H/HeJ、 C57BL/6J×DBA/2J 及C3H/HeJ×DBA/2J等产生的F1代雌鼠，也可以用4到6周CD1、KM等远源杂交系雌鼠。 2、可育雄鼠 可选用8周龄以上的C57BL/6J× CBA/J、C57BL/6J×SJL、 C57BL/6J×C3H/HeJ、 C57BL/6J×DBA/2J 及C3H/HeJ×DBA/2J等产生的F1代雄鼠，也可以用CD1、KM等远源杂交系雄鼠 3、结扎雄鼠 取6周左右的C57BL/6J× CBA/J、C57BL/6J×SJL、 C57BL/6J×C3H/HeJ、 C57BL/6J×DBA/2J 及C3H/HeJ×DBA/2J等产生的F1代雄鼠或者CD1、KM等远源杂交系雄鼠，按5ml/kg的剂量腹腔注射10％的水合氯醛麻醉，待其完全麻醉后，用虹膜组织剪剪去腹部被毛，用75％酒精檫拭消毒，用虹膜剪在沿腹中线靠近生殖器约1.5cm处开一约1cm长的开口，用弯头眼科镊子在腹腔内两侧各找到白色的脂肪垫，夹着轻轻往外拉直到睾丸外露，在睾丸的下方可见输精管，将另一眼科镊子在酒精等上烧红后夹住输精管，将其烧断。用同样的方法将另一侧的输精管烧断。缝和好创口，将小鼠保温安放，待其苏醒，术后一周，挑2-4只6周左右的雌鼠与之合笼，一个月后雌鼠未见怀孕则标志手术成功。 4、代孕鼠 由6周龄以上上述F1代雌鼠与结扎雄鼠交配所成。其性周期与受精卵供应鼠保持一致。 （三）受精卵的制备 本实验选用CD1背景鼠作为实验小鼠，选取10只5-6周龄的雌性小鼠，于下午1:00-2:00按5IU/只腹腔注射孕马血清(PMSG),46-48小时之后注射按5IU/只腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)。然后与可育雄鼠合笼交配，次日晨选出有阴道栓的雌鼠准备取受精卵。因为外源基因注入原核者整合到染色体上的比例最高，注人细胞质内的整合率很低。因此，取卵的时间应选在卵子受精后，雌雄原核已形成，但二者尚未结合的发育阶段为宜。取受精卵过程如下图：查栓当天10:00-12:00将有阴道栓的小鼠处死，经剥离后将 完整的输卵管带一小段子宫剪下，置于M2培养液中，在解剖镜下找到输卵管的膨胀壶腹部，用细尖头镊子撕开即见带有卵丘细胞的卵子自行流出。有时会遇到受精卵已从壶腹部迁移到输卵管的狭窄部位，此时可用冲洗的办法。先准备1毫升注射器和已磨钝的4号注射针头，吸取预热37℃ 的培养液，将取下的输卵管置于6厘米培养皿中，针头从喇叭口插人，并用镊子轻轻夹住喇叭口固定针头以防脱滑，这时慢慢地推动注射器即可见到卵子随培养液由子宫端流出。此法操作方便且不丢失卵子。随后将带有卵丘细胞的受精卵移入含有lmg/ml透明质酸酶,(Hyaluronidase)的M2培养液内，溶去卵丘细胞，立即用预先拉制的吸管将卵子吸至新鲜的M2培养液中洗涤2-3次，然后再将受精卵吸至另外新鲜M2培养液中，如此进行4-5次，直至视野中没有组织碎片和血细胞为止。最后将受精卵吸至已经CO2平衡的M16培养液滴中（约50ul），液滴上再覆盖一层胚胎级石蜡油，放入培养箱中培养，待卵原核发育清晰饱满后即可做显微注射。整个实验过程所用的解剖器械、玻璃器皿、溶液等，均需灭菌以防污染。 （四）代孕鼠的制备 在供卵鼠与可育雄鼠合笼当天，挑选处于发情期的CD1雌鼠（6周龄以上，最好生育过）与结扎雄鼠合笼，第二天早上检查交配情况，标记有阴栓者，可做代孕鼠。 （五）显微注射系统的建立 1、 注射针的拉制 选用外径为1mm，内径0.75-0.8mm带芯毛细玻璃管，装在水平拉针仪上，拧紧左右两侧的夹子，做好固定，并使其中间部位对准加热丝。设定好电流、拉力和时间。然后按开始键，等待毛细管被拉成两个所需的微注射针头。由于不同厂家生产的玻璃毛细玻璃管参数存在细微差异，所以，不同厂家同一型号的玻璃毛细玻璃管拉针参数组合不同，需要预先摸索。 为了防止空气中灰尘颗粒沾染注射针引起针尖阻塞，注射针需现用现拉制且最好使用硼硅酸盐玻璃的毛细管。另外可以采用硅烷对注射针头进行处理，以防样品和培养基成分与玻璃的亲水表面相互作用，从而引起针尖阻塞而影响注射。 如果拉制的注射针不虹吸DNA溶液，可将毛细玻璃管放入盛有0.1mol/L HCl的烧杯中浸洗2-4小时，然后用自来水冲洗数次，再用三蒸水清洗数次，经高压灭菌后即可利用。 2、持卵针的制作 选用外径为1mm，内径0.75mm无芯毛细玻璃管作为制作持卵针的材料，装在拉针仪上，拧紧左右两侧的夹子，做好固定，并使其中间部位对准加热丝。设定好电流、拉力和时间。按键拉出针坯，用细沙轮在直径为80-100um处将玻璃针切断，尽量使断面平齐，然后在煅针仪上处理断面，将断面烧圆；也可以先在煅针仪的铂金丝上烧制一小玻璃泡，在中温情况下将针坯直径为80-100um处贴上玻璃泡，偶后断电冷却玻璃泡，利用热胀冷缩断列针坯前端，尽量使断端平齐。然后对断面进行光滑处理。最后用酒精灯焰或煅针仪铂金丝在距针尖2-3mm处，将针坯弯成450（如下图）。 （六）显微注射操作过程 1、注射针头装液 将用注射缓冲液稀释的DNA溶液（1—3ug/ml）12000rpm离心5min， 用经三蒸水清洗过的移液头将上清转移至另一同样经三蒸水清洗的ependorf管中作为注射DNA。使用带芯毛细玻璃管拉出注射针，将针头后部浸入DNA溶液中，深度约为1mm，注意不要用手指或其他东西接触针头及针尖，通过虹吸作用，DNA溶液很快就到达针尖部。另外也可直接使用无菌的微量加样器从微注射针头的后部加入0.5～1μl的注射样品。 2、注射针头及持卵针的定位 将装液后的针头的游离端安在注射连接器上，然后旋紧连接器以固定针头，再将其固定到微操作仪的托针管上。同样将持卵针的针头安在卵固定连接器上，然后旋紧连接器以固定针头，再将其固定到微操作仪的托针管上。 3、 显微注射的操作： （1）在35cm的培养皿中央加一滴约50ul的M2培养基，加入5ml液体石蜡油并将培养皿液滴调整到显微镜视野中央，然后吸取10-20枚细胞核清晰的受精卵吹到液滴中央，在吹卵过程中尽量不要吹出气泡以免影响视野。 （2）用低倍物镜对准受精卵调焦，轻轻的落下针尖，并将注射针尖推入视野中心，通过微操作系统的微调调整注射针位置，直到清晰见到针尖为止。 （3）将目镜转到工作放大倍数（20×-40×），移动显微镜载物台，使注射针尖位于石蜡油中，转动注射针相连的注射器在注射针内形成正压，检验是否在针尖形成液泡，如果没有说明注射针被堵塞，换新的注射针。用同样的方法调整持卵针的位置，使持卵器开口端正对注射针尖。然后在中倍放大倍数（10×）下，调节持卵针注射器使持卵针内形成负压，吸取边缘清晰、形状饱满且细胞核明显的受精卵，通过改变注射器的压力，调整受精卵的位置，使受精卵的雄性细胞核正对注射针尖且两者之间的距离最小。将放大倍数调至工作倍数（目镜20×---40×），进一步调整显微镜焦距和注射针及持卵针的位置，使细胞核和注射针尖均达到最佳清晰程度。 推动操纵杆，小心进针，使注射针针尖进入细胞核。 （4） 加大注射压，直到细胞核明显胀大为止，。 （5） 轻而迅速往外拔针头，直到离开细胞。 （6） 移动显微镜载物台，找到下一个细胞，重复以上步骤。 注射完毕，将受精卵放回M16中，在细胞培养箱中继续培养，吸取下-批受精卵继续进行，直到注完为止。将注射过受精卵培养过夜。 [注意事项] 1 . 在整个过程中，严禁将注射针尖对着人员和仪器，因为注射针在持针器上安装不牢时或针尖堵塞，注射器、管子及注射针内的压力，可能将注射针射出。 2 .注射时注射器的压力不宜变化太快，否则会造成注射量操作难以控制，导致细胞核内环境改变过快过大甚至胀破细胞。 3 在注射过程中，常发生注射针阻塞，阻塞后，通常可通过将针尖轻轻敲击持卵针而得以缓解。如果不能解决，换用新的注射针。 4 在注射过程中，一定要避免针尖刺入核仁。 （七）动物显微手术 如果操作过程损伤较小，经一夜培养，一般会有90%以上的受精卵发育到二细胞期。这些胚胎就可以移植到假孕鼠的输卵管中。 1、先用胚胎移植针将二细胞期胚胎从M16培养基中转移到M2培养基中，洗一两次，换一新的移植管，吸取一小段石蜡油和少许M2培养基，紧接着吸取10-15枚注射过二细胞胚胎（如下图）。 2、按5ml/kg的剂量腹腔注射10％的水合氯醛麻醉受体鼠，待其深度麻醉后，用虹膜组织剪剪去背部被毛，用75％酒精檫拭消毒，在后正中线与平肋缘水平线交点旁1cm处，开一长约1cm的纵行切口，即可见到一白色的脂肪垫，用弯头虹膜镊子将其拉出，使卵巢外露，卵巢下面即为输卵管。在显微镜下，用显微镊小心撕开输卵管与卵巢包膜，找到输卵管的开口，迅速将胚胎移植管插入其中，吹入胚胎，同时要避免吹入过多的培养基和石蜡油。用同样的方法进行另一侧输卵管的胚胎移植。 3、将假孕小鼠保温安放，待其苏醒。 [注意事项] 1、 在撕包膜过程中，要尽量避免出血，否则血液进入胚胎移植管后很快凝固，阻塞胚胎移植管。 2、不要吹入太多的培养液和石蜡油，改变输卵管的内环境，造成胚胎发育异常甚至胚胎死亡 （八）转基因小鼠的鉴定 待代孕鼠生出的小鼠生长10-15天，剪0.3cm尾尖，放入到30ul组织裂解液中，60℃消化数小时，直到看不到固形物为止，然后加入270ul双蒸水，于沸水中煮5-10min，10000rpm，离心2min，取0.5ul上清进行PCR鉴定。 本文来源：https://www.wddqw.com/doc/8f8f67c182c758f5f61fb7360b4c2e3f572725d4.html