货号: QS2405-25 规格：25管/12样 酰基转移酶 （alcohol acyl transferase，AAT）活性测定试剂盒说明书 可见分光光度法 注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： AAT是一个多功能蛋白大家族，主要负责催化生物体内各种酰基化和去酰基化反应，在基因表达、代谢和信号传导中具有重要作用。 测定原理： AAT催化乙酰CoA转移乙酰基到丁醇，同时还原DTNB生成TNB；TNB在412nm有吸收峰，测定412 nm吸光度增加速率，来计算AAT活性。 自备仪器和用品： 研钵、冰、台式离心机、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪和蒸馏水。 试剂组成和配制： 试剂一：液体×1瓶，4℃保存； 试剂二：液体×1瓶，4℃保存。 试剂三：粉剂×1瓶，-20℃保存。临用前加蒸馏水1.3 mL充分溶解，4℃保存。 试剂四：液体×1支，4℃保存。 试剂五：粉剂×1瓶（棕色），4℃避光保存。临用前加入试剂二1.3 mL充分溶解，4℃避 光保存。 粗酶液提取： 1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。16000g，4℃离心20min，取上清，置冰上待测。 2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后16000g，4℃，离心20min，取上清置于冰上待测。 AAT测定操作： 1. 分光光度计预热30min以上，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。 2. 试剂二在37℃水浴保温30 min以上。 3. 空白管：依次在1mL玻璃比色皿中依次加入100μL蒸馏水、700μL预热的试剂二、50μL试剂三、100μL试剂四和50μL试剂五，迅速混匀后于于412nm比色，记录10 s和130 s的吸光值，分别记为A1和A2。△A空=A2-A1。空白管只需做1个。 4. 测定管：依次在1mL玻璃比色皿中依次加入100μL上清液、700μL预热的试剂二、50μL试剂三、100μL试剂四和50μL试剂五，迅速混匀后于412nm比色，记录10 s和130 s的吸光值，分别记为A3和A4。△A测=A4-A3。如果△A测偏低，可以延长反应时间，如测定10 s和310 s的吸光度，相应修改计算公式中反应时间。 AAT活性计算： （1）按照蛋白浓度计算 第1页，共2页 活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟催化吸光值变化0.001个单位为1U。 AAT (U/mg prot) = 1000×（△A测—△A空）÷(Cpr×V样) ÷T= 5000×（△A测—△A空）÷Cpr Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定；V样：加入反应体系中上清液体积，0.1mL；T：反应时间，2 min。 （2）按照样本质量计算 活性单位定义：37℃中每克组织每分钟催化吸光值变化0.001个单位为1U。 AAT (U/g) = 1000×（△A测—△A空）÷(W×V样÷V样总) ÷T= 5000×（△A测—△A空）÷W W：样本质量，g；V样：加入反应体系中上清液体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，2 min。 （3）按细胞数量计算 活性单位定义：37℃中每104个细胞每分钟催化吸光值变化0.001个单位为1U。 AAT (U/104cell) = 1000×（△A测—△A空）÷(细胞数量×V样÷V样总) ÷T= 5000×（△A测－△A空）÷ 细胞数量 V样：加入反应体系中上清液体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，2 min。 注意事项： 上清液蛋白质含量需要另外测定。建议购买本公司生产的BCA蛋白质含量测定试剂盒。 第2页，共2页 本文来源：https://www.wddqw.com/doc/97fc915403020740be1e650e52ea551811a6c965.html