色谱柱是HPLC分离过程的核心一支稳定
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1 第5章 色谱柱 5-1引言 色谱柱是HPLC分离过程的核心。一支稳定、高效的色谱柱对建立普适性强、重现性好的方法是必不可少的。不同供应商的色谱柱，甚至来源相同、认为完全一样的色谱柱之间，可能也会存在很大差异，尤其是不同的色谱柱在塔板数、谱峰的对称性、保留值、峰间距以及使用寿命方面会有所不同，而这些不同对建立理想的HPLC方法会产生很大影响。本章中，我们将提供一些有关色谱柱担体、固定相及柱填料的信息供读者参考；讨论色谱柱应用中的问题，以及适宜的解决方案，以确保方法普适性强、重现性好，同时也讨论了在常规HPLC分析中，为获得最佳结果，一支“好”色谱柱的重要意义。 选择HPLC柱时，大多数使用者都认为柱间的重现性是方法建立中极为重要的因素。色谱工作者不愿在校准了一具体系统后，又不得不为一新色谱柱再重新建立HPLC方法。一些生产厂能在一定程度上保证柱性能指标的重现性，如色谱柱塔板数（N），特定样品与条件下的选择性，反压（压力降），特定测试溶质的保留值（k）。因此，对许多使用者来说，生产优质产品的厂家的信誉很重要。价格对一些用户是重要的因素，但上述讨论的其它因素在建立一个普适性强、令人满意的方法时往往更加重要。色谱柱价格在建立和应用普适性强、可靠的HPLC方法的整个费用中，仅占一小部分（见5-3节）。 5-2色谱柱与柱填料的特性 5-2-1柱填料 大多数用于HPLC分离的柱填料使用硅胶微粒（作担体）。基于多孔聚会物担体或其它材料的色谱柱也已商品化，这些非硅胶填料由于有其特殊的应用，以后再作讨论。由于硅胶担体与键合的有机表层（如C18或C8），应用范围广，我们将作重点讨论。 图5-1所示为HPLC中常用的几种微粒类型。由于全多孔微球很好地兼顾了众多理想的性质：效能、样品荷载量、耐久性、方便性以及有效利用率等，所以最为常用。这些微粒有不同的粒径、孔径和表面积供选择，所以用这些物质能建立各类HPLC方法。 固定相外壳扩散孔固体核实心微球全孔微球通孔灌注微粒 图5-1的微粒类型（图示大致为所用微粒的相对大小）。 实心微球型微粒固定相有一实芯核，起作用的是其表面很薄的外壳。这些硅胶或聚会物基质的微粒，通常为1.5~2.5μm，因为其快速传质的动力学过程，对大分子有突出的福利效能。因为这些实心超小微粒的表面积较小，样品容量有限，所以仅适于分析型HPLC。这种超小微粒的色谱柱出峰极为尖锐（小体积），因此要求所用HPLC仪器的柱外峰展宽因素极小，以避免峰展宽。 1 02 灌注色谱填料包含孔径达4000~8000A（艾）的贯穿孔，而且在这些贯穿孔网络中还有较小的内联孔（如300~1000A（艾））。在高流速时，溶质可通过对流和扩散的共同作用，进入（并离开）该孔结构。其效果减少了峰展宽，所以大的多孔微粒在柱效方面与小微粒相当，但压力降却小得多。目前这种类型填料的使用还较少，因此，其实用性还有待于进一步探讨。不过，这种填料似乎非常适于大分子如蛋白质的制备分离，用于小分子的日常分析分离则较少。 颗粒大小（粒度）在HPLC中极为重要。约5μm的微粒直径很好地兼顾了分析柱的柱效、反压和寿命。更小的多孔微粒（如3μm）对快速分离很有用。小至1.5μm的薄壳微粒对极快速地分离蛋白质等大分子较有用。较窄的粒度分布（<±50%均值）能保证填充床的稳定、高效和压力降最小。总的说来，3或5μm全多孔微球填充HPLC色谱柱，能满足大多数分离的需要，我们推荐大多数的方法建立用这些粒度的色谱柱。 表5-1总结了HPLC分离用微粒的理想的物理特性，以及它们的重要性。一般使用027~12nm（70~120 A（艾））孔径的全多孔微粒。表面积150~400m/g的全多孔微粒分离小分子较有利。表5-2列出一些窄孔径C18商品柱的典型物理性质。对于分子量大于10000Da分子的分离，需用孔径大于15nm的微粒，使这些溶质容易进入到微孔结构内部的活性表面。各种情况下，都应保证溶质在微孔里能迅速扩散与柱效良好。孔径至少是溶质流体动力学直径的4倍，才能确保溶质的有限扩散不至于使柱效下降。大孔微粒的比表面积有10~150m/g不等，取决于微孔直径的大小；孔径越大表面积越小。 表5-2 分析柱的理想的微粒特性 特性 5μm全多孔微粒 3μm全多孔微粒 1.5μm薄壳微粒 ±50%（均值的）粒径分布 7~12nm孔径，150~400m2/g（小孔） 15~100nm孔径，10~150m2/g（小孔） 色谱柱 Hypersil ODS LiChrosorb C18 Novapak C18 Nucleosil C18 Symmetry C18 Zorbax ODS Zorbax Rx，SB，XDB 用途 大多数分离 快速分离 极快速分离（尤其是大分子） 稳定、重现、高柱效、柱压低 小分子分离 大分子分离 20表5-2 一些C18色谱柱硅胶担体的物理性质 孔直径（nm） 12 10 6 10 10 6 8 表面积（m2/g） 170 355 —— 350 335 300 180 体积孔隙率% （ml/ ml） 57 71 —— 69 66 5 50 5-2-1-1硅胶填充微粒 如前所述，硅胶基质是目前最为常用的HPLC柱填料。这主要是基于硅胶担体良好的物理特性。通过控制全多孔硅胶微粒的制作工艺，能够得到平均孔径变化范围宽（如8、30、100μm）、孔径分布范围窄和粒度选择性较大（如10、5、3μm）的填料。能满足大、小分子的分析及制备。大多数硅胶微粒的突出优点是它们的机械强度很高，这一点可保证填充床长时间在很高的操作压力下工作，柱效保持稳定。刚性、高强度的微粒还使柱的反压较低，寿命较长。在用于制作HPLC填料的材料中，硅胶基质色谱柱的柱效最高，这也是其重要优点之一。 球形与不规则形硅胶微粒在色谱中均有使用，但球形微粒具有一些特有的优点。球形微粒强度高，更易装填成高效柱，重现性好。不规则形微粒填充柱开始时与相同粒度的球形柱 2 3 的柱效相当，但使用中往往会产生较高的反压（由于不规则形微粒的破碎，产生“细粉”）。因为价格低与其它的考虑，不规则形大微粒广泛应用于制备与处理（见第13章）。 硅胶担体的表面性质极为理想，在于其表面能通过化学改性（修饰）引入种类繁多的、具有不同官能团的键合相。硅胶基质填料与水及所有有机溶剂兼容，在更换溶剂时，填料的大小不会变化（如溶胀）。这种特性使填充床在用各种类型溶剂时以及使用梯度洗脱期间，仍能保持稳定。 作为HPLC色谱柱的担体，硅胶并非完美无缺。在高p H时硅胶能溶解。要获得满意的使用寿命，不应在p H8以上使用某些硅胶基质的色谱柱（即通常用可溶性硅酸盐沉淀制成的所谓“Sol——gel”氧化硅胶或干凝胶类型）。然而，基于聚集硅溶胶制得硅胶微粒的色谱柱（称为溶胶凝胶型），至少可在p H9条件下操作。p H>9时，硅胶担体能迅速溶于某些流动相中，最终造成填充柱床塌陷，伴随柱效的遽然下降，峰不对称性加剧。（有时，在特定流动相条件下，一些溶胶-凝胶型硅胶基质填充色谱柱能在p H11下工作，结果良好；见5-2-3-4节）硅胶基质的另一个缺点是其表面的酸性，不适宜分离碱性化合物。幸运的是，如下所讨论，新型的高纯硅胶担体的酸性较弱，能最大限度地减小碱性溶质时存在的问题。 HPLC球形多孔硅胶的合成，可采用一些不同方法。图5-2所示为一些商品硅胶微粒的外观比较（表面形貌，形状和粒度分布）。由于其表面积、纯度、孔径分布和表面化学的不同，会表现出不同的色谱性能。 略 图5-2 一些多孔硅胶微粒的透射电镜照片。 未改性硅胶表面化学性质随制备条件而变化，文献中已有讨论。水合硅胶含有硅羟基表层（-SiOH）。加热高于8000C时，这些硅羟基大部分会被脱掉，在HPLC中已无使用价值。用于HPLC的硅胶应完全羟基化，水合硅胶表面的硅羟基最大浓度约为8μmol/ m，这时使用效果最佳。 如图5-3所示，水合硅胶的表面含有不同种类的硅羟基。如图5-3上图所示，硅羟基一般有三种存在类型。这些不同类型的硅羟基可用幻角自旋（MAS）的Si NMR法与傅立叶变换的漫反射红外光谱法（DRIFT）进行鉴别并测定。自由或孤立（无氢键键合）的硅羟基一般产生于低浓度中，这些自由硅羟基由于其酸性很强，能与碱性溶质产生强烈无益的结合。因此，含自由、酸性硅羟基浓度高的硅胶往往使碱性样品的保留值增加，峰变宽、拖尾。 OHOHOH2OHOHSi自由硅羟基Si双硅羟基SiSi缔合硅羟基OHM表面金属MSi内部金属（活化硅羟基） 图5-3 HPLC硅胶担体的表面 完全羟基化的硅胶基质填料，具有最高浓度成对的与缔合的硅羟基（见图5-3），最有利于碱性化合物的色谱分离。这些硅胶表面的成对硅羟基浓度往往很大（见图5-3），有时可达总数的25~30%。成对的硅羟基的酸性比自由硅羟基的弱，一般分离碱性溶质较“顺利”。完全羟基化的HPLC硅胶缔合的或氢键键合的硅羟基浓度最高，所以最理想。硅羟基酸性 3 4 小，分离碱性溶质较“顺利”。一些商品硅胶填料为部分羟基化状态，填料通常酸性较强，不适于分离碱性化合物。 硅胶担体的纯度对许多极性化合物的分离也极为重要。如图5-3下图所示，某些硅胶被一定金属污染（Fe、Al、Ni、Zn等）。这些金属杂质能与螯合溶质络合，引起不对称或峰拖尾，甚至化合物完全被保留，不能洗脱出。硅胶晶格中的其它金属（尤其是铝）能使表面硅羟基活性增强，酸性增强。因此，许多HPLC分离，尤其是碱性与强极性化合物需用高纯硅胶。这些硅胶的纯度极高，如表5-3中分析的一种类型所示。用色谱试验来说明硅胶表面酸性与螯合或络合效应已有报道。 表5-3用ICP-AES/MS法分析Zorbax Rx-SIL硅胶的典型微量元素 元素 Na Ca K Al Fe Mg Zn a含量a（ppm） 10 2 <3 1.5 3 4 1 总量：<35 ppm（未检出其它元素，<1 ppm）；99.995%。 有些色谱用硅胶，按它们作为色谱柱担体分离碱或酸性化合物的理想程度，被评定分级。过去的纯度不高的酸性硅胶（称A型硅胶），能用于分离中性和非电离的化合物。新型的高纯度的弱酸性硅胶（称B型），一般对离子或可电离的化合物，尤其是碱性物质分离较好。表5-4列出了一些可用于分离碱性化合物的新型硅胶名单（以字母顺序排列）。随着使用者与生产商对这些高纯度硅胶制成的色谱柱优点的认识，表5-4还会继续快速增长。图5-4比较了用C18柱分离碱性药物的一些情况，有的为A型硅胶，有的为B型硅胶作基质。以弱酸性硅胶为担体的色谱柱（B型）表现出优良的谱峰形状与柱效。用不同的硅胶担体往往会使化合物的保留值、峰间距与峰拖尾有很大的差异。减小这些差异的技术将在7-3-3节中进行讨论。基于B型硅胶所表现出的特殊优势（见表5-4），将来有可能需要在大多数的HPLC方法建立中使用（包括碱性与非碱性样品）。 5-2-1-2多孔聚合物 用多孔聚合微粒填充的色谱柱也可用于HPLC。这些聚合微粒中有些（如聚苯乙烯）是疏水性的，可直接用于反相分离，而不需添加表面涂层。用于反相HPLC的大多数聚合微粒由二乙烯基苯交联的聚苯乙烯制成，类似于那些用作离子交换剂的树脂。其它聚合物微粒，如取代异丁烯酸与聚乙烯醇，也已经商品化，但用得还不多。全多孔与薄壳型微粒均有。与硅胶担体一样，孔径较小的多孔聚合微粒用于小分子溶质，孔径较大的用于大分子的分离。多孔聚合物的主要特点是在p H1~13均可用。这些色谱柱能在高p H下分离强碱性溶质，这时化合物以自由态和非电离态存在，色谱峰形较好。见图5-5的应用示例。该方法分离这类化合物，可替代离子对色谱法（见7-4节的离子对分离碱性化合物），而且流动相中不必添加离子对试剂。多孔聚合物的另一潜在优点是有很强的疏水保留性（相对于硅胶基质的C18柱），对亲水性较强的化合物也有足够的保留。大孔的多孔聚合物对蛋白质样品的分离非常有用（见11-2节）。因为多孔聚合物在高p H时很稳定，强保留物质可用0.1M的氢氧化钠从柱中洗脱。 与相同粒度的硅胶基质色谱柱比较，多孔聚合物柱的缺点是柱效低。已有的应用文献表明，它的塔板数一般不到类似的硅胶基质色谱柱的一半。聚合物柱还有一个特殊问题，这种担体在不同有机改性剂中溶胀程度不同。因此填充床会因微粒溶胀不同而变化，该性质可能是聚合物柱效率低的原因。在梯度洗脱中更明显，因为分离过程中有机溶剂浓度是变化的。 4 5 为尽量减小可能的问题，一些色谱工作者只在单一有机改性剂的等度分离中才用聚合物基质柱。 A型硅胶Zorbax-ODS二甲基-C181234检测器响应B型硅胶Zorbax Rx-C18二甲基-C181321、多虑平 0.125ug2、去甲丙咪嗪 0.25ug3、阿米替林 0.25ug4、三甲丙咪嗪 0.25ug024681012141618保留时间（min）20222426 图5-4 以A型与B型硅胶担体的色谱柱分离三环抗抑郁药的比较 色谱柱：15×0.46 cm；流动相：乙腈-0.025M磷酸钠缓冲液（30：70），p H2.5+三乙胺与三氟醋酸各0.2%；流速：1.0ml/min；400C；254nm检测；进样5μL。 表5-4推荐用于分离碱性化合物的一些硅胶基质担体与色谱柱 Altima Betasil DeltaBond Encapharm RP Hypersil –DBS Inertsil Kromasil LiChrospher Select B Nucleosil AB RSIL Supelcosil ABZ+ Supersphere RP Symmetry Synchropak RP-SCD Techspere-BDS Vydac YMC-Basic Zorbax Rx，SB，XDB 通过改变色谱柱硅胶基质的官能团，可以变其反相分离的选择性（见6-3-3节）。以其它官能团改性的多孔聚合微粒，如C18、NH2和CN，也可改变固定相的选择性。不过，目前用于聚合物色谱柱的功能团仅有几种。 改性聚合物柱填料应用于某些离子交换有明显优势。多孔聚合物（例如：二乙烯基苯交联的聚苯乙烯）加可电离的官能团，如-COOH、-SO3H、NH2和NR3+，为分离众多的酸性与碱性化合物提供了可能，这些柱填料物质用于生物样品的分离、提纯最多。这些分离常需要在高p H下操作，如清除内毒素和其它生物污染物。在这类应用中，与硅胶基质柱相比，多孔聚合物的优点是稳定性更好。但与硅胶基质的离子交换剂比较，聚合物基质离子交换剂通常与其它聚合物基质柱填料存在同样的缺点：柱效低、分离慢。 5-2-1-3其它无机填料 其它用于HPLC的无机担体填料色谱柱也已经商品化。由于其特殊的性质，它们一般用于特殊的应用，然而，这些无机填料的使用经验比已广泛应用的硅胶基质柱的和多孔聚合物柱的少得多。未衍生化的石墨碳正逐步被接纳为反相色谱柱的填料，已 5 6 经制得具各种粒度的多孔小球。用这种填料的分离略不同于硅胶基质烷基键合相。石墨碳的表面即是保留的基础——不再需其它固定相。该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物的保留强。石墨碳已证明可用于分离某些几何异构体，如图5-6所示。石墨碳柱也可用于保留与分离那些因亲水性太强、在C18键合相柱上保留较小的化合物。如已分离了药物等一些极性化合物。由于在HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何p H与温度下使用。 19.00美西津17.00振幅/100015.00赋性剂13.00111.000.004.008.00t/min12.0016.00 图5-5 p H11时多孔聚合物柱的色谱图 美西律及其片剂基质，添加1%的杂质（Ⅰ）。色谱柱：12.5×0.4 cm Ashipak ODP-50；流动相：28：72 （v/v）乙腈-水，用二乙胺调p H至11；流速：0.9ml/min；400C；264nm检测；进样20μL。注意杂质的吸收系数比较大。 石墨碳色谱柱与硅胶微粒相比，其缺点是柱效低、极易碎裂。用一些流动相/溶质系统，尤其是大k值的组分，不易获得好峰形。杂质往往会聚集于柱床上，最终以背景干扰流出。因此，石墨碳柱要求用高纯流动相，被吸附的杂质会不可逆地改变色谱柱的性能，所以样品清除布置对延长色谱柱寿命很有用。这种材料的色谱柱仅有短柱，而且比较贵。目前可供选择的孔径还不多。 小孔与大孔的氧化铝也可用于HPLC。氧化铝被制成不同的粒度，但不象色谱用硅胶的品种那么多。氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的柱床。未经改性的氧化铝能在正相条件下分离弱极性溶质（见6-6节）。氧化铝担体用聚合相进行涂层后，如聚丁二烯，可进行反相分离。通过烯烃与硅氢改性氧化铝担体的作用，也可制得烷基改性固定相，但商品固定相官能团种类的范围非常有限。 氧化铝基质填料的一个优点是可在p H高达12的流动相中使用。强碱性化合物用高p H的流动相，不加离子对试剂即能分离。氧化铝基质的填料不能用于羧酸样品，因为这些化合物与氧化铝不可逆地结合。有些商品氧化铝对碱性化合物也很活泼。除了流动相p H值可高 6 7 于10，氧化铝基质的应用与硅胶的相当类似，无明显的优势。因而，氧化铝柱尚未达到广泛应用的硅胶填料柱的认可程度。 反式-反式反式-顺式010CIS-trans20时间（min）30顺式-顺式响应40 图5-6 在石墨柱上分离顺-反异构体。 样品：平喘药（ly170680）；色谱柱：10×0.4 6cm Hypercarb；流动相：630ml甲醇与320ml二氯乙烷，加6.8ml三氟醋酸；流速：1.0ml/min；UV 检测器264nm。 氧化锆基质的填料也可用于HPLC。多孔微球与无孔超微球的制备与应用均有报道。然而，目前商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球柱。这些坚固的填料可用于所有已知的HPLC洗脱剂，p H范围1~14，温度高达1000C。氧化锆基质柱在高p H下的操作能力使其能用于分离未电离的强碱性化合物。这些方法可替代通常硅胶基质柱在低p H或用离子对色谱法分离该类化合物。由于氧化锆填料是最近几年才开始研究，不同粒度、孔隙度的固定相目前尚没有。因此，目前氧化锆柱填料比硅胶与聚合物基质的材料有什么重要用途与优势尚无定论。 用氧化锆柱的一个实验难题是必须严格除去二氧化碳。否则，氧化锆表面与二氧化碳牢固键合，会改变其色谱性质。另一个考虑是氧化锆也会牢固地与氟化物、磷酸盐以及其它路易斯酸键合。该性质说明必须用含有这些阴离子的流动相仔细地预处理该担体的表面，以保证分离的重现性。氧化锆表面还与羧酸及磺酸牢固地键合，或许也不可能分离含有这些化合物的混合物。 5-2-2色谱柱的构型 大多数用于HPLC的色谱柱是用一节内壁经高度抛光处理的直不锈钢管，用收缩接头将其与HPLC仪器连接。不锈钢可用于所有有机溶剂与大多数水性缓冲液。然而，含氯的流动相会缓慢地“卤素腐蚀”不锈钢材质（尤其在低p H时），所以使用该流动相时应倍加小心。综合考虑的话，大多数HPLC用不锈钢色谱柱最好。也有用玻璃、玻璃衬里不锈钢与塑料制作的商品柱，用于可能与不锈钢发生有害作用的特殊样品。然而，资料中能证明不锈钢柱发生这类问题的很少。这些与不锈钢成分（铁、铬、镍）牢固络合的样品最有可能产生这类问题。色谱柱内壁的表面积很小，所以发生不良反应的机会不大。 多孔烧结物（滤片）封闭色谱柱的两头，固定住填料微粒。一般来说，5μm与3μm的微粒分别用2μm与0.5μm孔径的不锈钢滤片。不锈钢柱发生的问题，通常要追溯到入 7 8 口不锈钢滤片，它的表面积比可能与样品发生不良反应的色谱柱内壁要大得多。峰形不好与样品回收率低，可能预示滤片出现问题。多孔钛与聚合物滤片的活性弱，可用于对付这类偶尔发生的问题。 有人建议分离生物样品时用玻璃柱，由于受压力的限制（如<1000 psi），其应用受到限制。玻璃衬里的不锈钢柱可用常规的HPLC压力，但这些组件较易碎裂，需小心使用。经验表明，玻璃柱分离生物样品的需求并不多，（方便的）不锈钢柱足以应付大多数的应用。在用其它材料不合适时，可用带有聚合物接头的刚性聚合物（PEEK）柱。这些色谱柱具有铝外壳，能承受较高的操作压力。 也有弹性聚合物外壳的色谱柱。径向加压柱（美国WATERS公司）借助液体对柱半径的压力，可随时对填料物质加压。这种类型柱的优点是价格低，而且是非金属结构。然而，由于形成最佳填充柱床可能有困难，用该法时柱效以及柱间的重现性可能不好，这类柱的控温也有困难，如需连接加长柱时，需另外的液压装置。 对收缩接头柱，不同填料均可应用。如果制作良好的话，这类色谱柱的柱效与重现性水平最高。另外，价格低的不锈钢卡套柱也有各种尺寸与不同填料类型。卡套柱实际上是装有填料的空管坯（两端未装接头）。用可重复使用的柱架与接头将这些填充管连接于HPLC仪器上。这些廉价的卡套柱对常规测定，尤其不需极高柱效时，极其诱人。为较低费用，生产厂商一般不对每支卡套柱效进行测定。而在随机从每批中选择测之。不过，通常都标有最小柱效，而且有时能为每个组件进行担保。 表5-5总结了商品色谱柱构型。建立分析方法通常用内径0.46 cm或0.3 cm、粒度3~10μm的色谱柱最好。5μm微粒的色谱柱通常可兼顾理想柱效、重现性和可靠性。3μm微粒的色谱柱能快速分离或柱效高，如2-3-3-1节中的讨论。然而，3μm柱的常见问题是它们可能更易发生堵塞，大大降低了色谱柱的寿命。带有压缩接头的色谱柱适于大多数应用，尤其是那些操作压力高的长柱。通过改变分析柱长度几乎能对所有的应用进行优化。 表5-5色谱柱构型（不锈钢）a 类型 分析型 加压柱头 卡套 微球 半制备型 制备型 内径（cm） 0.3——0.46 0.3——0.46 0.1，0.21 0.8——1.0 2.0——5.0 长度（cm） 3——25 7.5，10 15，25 10——25 10——25 粒度（μm） 3——10 3——10 3——8 5——20 5——20 a在某些构型中，也可采用玻璃、玻璃衬里、塑料与PEEK材质。 3.5μm微粒填充的色谱柱似乎能很好地兼顾高效与柱寿命。与5μm微粒柱比较，柱效有明显改善；在柱长度相同时，用一半分离时间能获得与其相当的分离度。而且在使用高流速时，柱效损失并不大，所以，如需要，可进行快速分离（见图5-18）。由于3.5μm微粒柱使用2μm孔径的入口滤片，比传统的3μm微粒柱使用的0.5滤片的堵塞倾向要小得多。3.5μm微粒柱要求粒度分布窄，无“细粉”，使色谱柱的反压适中。 0.3cm ID色谱柱的溶剂消耗只是广泛使用的0.46cm柱的一半，当用0.21cm细径柱时，可比0.46 cm ID柱减少4倍，而0.1cm ID的细径柱可用的分析溶剂更少，这些组件有的长度可达25 cm，粒度范围在3~8μm之间。细径柱的主要优点的单位质量样品的检测灵敏度高。这些构型最适于受质量限制（非体积限制）样品的应用。当HPLC仪器与质谱仪及其它需输入小体积溶剂的仪器联用时，细内径色谱柱特别有用（并往往是必须的）。由于用这些细径柱不易得到均一的填充床，有时塔板数会低于同类的0.46cm ID柱，而且，柱外效应往往极为明显，尤其是柱内径小于0.3 cm时，可能需特殊的仪器组件才可获得满意结果。 8 9 如表5-5所示，带收缩接头的半制备和制备型不锈钢柱，常用的内径范围为0.8~5 cm。（尽管更大的内径也已商品化，但通常更适于中试装置与处理操作。）这些半制备和制备色谱柱中填充的往往是柱效低的大颗粒（如10~15μm）。当分离的样品量很大时，色谱柱效就不那么重要了。 表5-5中未列出内径细达50μm的熔融石英填充式细管柱。有几家供应商可提供这些色谱柱，主要用于与质谱仪连接，对大多数的常规应用不大适合。这类柱的一般应用尺寸为25或50 cm×380μm ID。用于该构型的微粒一般为3~5μm，但更小的有报道。当用这些柱时，必定需要特殊仪器，因为峰体积极小，极易引起峰展宽。 5-2-3固定相 5-2-3-1键合硅胶 硅胶基质的反相填料一般通过在担体表面上共价键合有机硅烷或沉积聚合物有机涂层。图5-7所示为使用最广泛的有机硅烷填料的表面反应式。许多键合相填料用单官能团试剂制得，如图5-7a所示，也有些商品填料是用三官能团（有时也用双官能团）硅烷与胶硅表面反应的交联型聚合表层（图5-7b与c）。图5-7 c中的方法一般用于引入能与氯硅烷反应的R基团（如氨基或二醇基相），这些反应通常用三官能团硅烷[如（EtO）3-Si-（CH2）3-NH2]，重现性往往不好。 aSi-OH+Cl-Si(CH3)2RSi-O-Si(CH3)2RSi-OHSi-O+Cl3SiRSiClRSi-ObSi-OHSi-OHcSi-OHSi-O+(Eto)3SiRSi-OSi(OEt)R图5-7 键合相填料的化学反应。 （a）表面硅羟基与氯二甲基硅烷的反应；（b）表面硅羟基与三官能团硅烷的反应；（c）表面硅羟基与三官能团烷基硅烷的反应； 图5-8所示为与硅胶担体共价键合硅烷的各种类型。图5-8a所示为用双或三官能团硅烷反应的轻度纵向交联相。由这些反应得到的聚合键合相，在低p H时，可能比单体相的非交联固定相更稳定，但与用单官能键合相比较，用此方式制得的填料的保留值与选择性却更不稳定。图5-8b所示为另一类型的键合硅烷的表面，称作横向交联。有报道表明这些物质在低p H与高p H环境中均非常稳定，但没有有关保留值、稳定性与重现性特性的应用数据。 如图5-8c和d所示，不同非交联型柱填料也已商品化。通常通过单官能团二甲基氯硅烷与表面硅羟基反应（见图5-7a）得到各种烷基与取代烷基改性胶硅，如：正-十八烷基硅烷（ODS或C18）键合相材料。如图5--7a所示，单官能团硅烷反应的优点是重现性好，一个硅羟基与一个硅烷分子反应，产生可预测的结构。该反应路线制得的填料往往柱效最高，由于溶质分子在薄固定相层内的扩散迅速。存在的二甲基取代及位阻保护结构两种，讨论见下文。 9 10 A、纵向交联B、横向交联OSiOOOOOHSiOOHOHOOHSiSiSiSiOOOOD、单体（空间保护）SiSiSiOOOOSiSiSiSiOSiSiSiSiSiSiOOOHOHOSiSiOHSiC、单体（二甲基-取代）SiSiSiSiSiOOHOOHOSiSiSiSiSiSiOOHOOHOHSiSiSiSi 图5-8 C18硅烷键合相的种类 许多生产厂家试图使硅胶表面与硅烷致密地（“完全地”）进行反应，然而，由于键合相配位体的空间位阻效应，表面的硅羟基不能完全参加反应。如表5-6所示，随着链长或硅烷体积的增大，参加反应的硅羟基比例相应减小。即使最小的硅烷（三甲基或C1），其表面上也有近50%的硅羟基未被反应。这些硅羟基位于有机硅烷配位体的“保护伞”下，但仍可与适宜的溶质发生静电作用。如何尽量减少不良的残余硅羟基的影响，建立重现性好、普适性强的方法，将在第5章中重点讨论。 表5-6硅烷键合相链长与体积对硅胶表面覆盖率的影响 键合相 三甲基 二甲基-3-氰丙基 二甲基-正-丁基 二甲基-正-辛基 二甲基-正-十八烷基 三异丙基 二异丙基-3-氰丙基 二异丙基-正-辛基 二异丙基-正-十八烷基 表面覆盖率（μmol/ m2） 4.1 3.6 3.5 3.2 2.7 2.2 2.1 2.0 1.9 反应的硅羟基a（%） 51 45 44 40 34 28 26 25 25 a按完全羟基化、未改性的硅胶为8μmol/ m2。 有些硅烷键合相（如C8、C18）的生产厂家用被称为“封尾”（endcapping）的工艺，使硅胶担体表面完全反应（硅烷化）。封尾包括键合填料与小硅烷进行的后续反应，如三甲 10 11 基氯硅烷、二甲基二氯硅烷或（不经常的）六甲基二硅氮烷。这种方法通过反应掉一些残余硅羟基，增加担体的覆盖率，以尽量减少与溶质发生不良的作用。然而，封尾并不能完全克服酸性硅胶担体的缺点，而且这些小分子的封尾基团在低p H反相分离的中，极易从填料上水解下来，使该方法在p H<3时，普适性好、耐用的优点不强。研究表明被封尾的色谱柱在中等与高p H（6~9）时，可能更稳定，因为较好地保护了硅胶担体不被溶解。 5-2-3-2其它固定相 其它通过共价键引入有机固定相的方法已有报道，但还没有基于这些方法的商品柱。如前提及，通过在担体表面聚合各种单体制得的固定相，如以聚丁二烯改性的氧化铝和氧化锆柱填料与其它聚合物固定相已商品化。不过，可能是因为这些类型的聚合物色谱柱并不比常规的键合相柱填料的优势明显，它们尚未受到高度欢迎。 5-2-3-3RPC中键合相的保留行为 键合相填料的有机物含量（如百分含碳量）大致能说明一特定色谱柱的的保留能力。键合相担体的表面积是一主要因素；表面积越大，保留值（k）就越大。对于仅为疏水作用的分离，只要其有机配位体能完全接近溶质，保留值随含碳量的增加而增加。有时溶质的保留是有机固定相的疏水作用以及硅胶担体上硅羟基的正相作用的混合保留机制的结果（见图6-27 c与有关的讨论），这种情况下，含碳量作为色谱柱保留的标志则不甚显著。 样品保留值一般随键合碳链长度而增加（C18> C8> C3> C1），但长链之间的差别并不大（即C8 ≈C18）。通过选择键合相，可将样品保留值控制在一定的范围内，但保留值的变化也会随色谱柱填料的表面积与所用硅胶担体类型的改变而变化。图5-9是不同生产厂家的多种C18 和C8键合相柱上，几种中性、碱性与酸性化合物的k值。也列出了这些色谱柱的死体积（用不保留的尿嘧啶标记测定），以及用该流动相测试化合物是否产生拖尾峰。本图中的色谱柱以中性溶质甲苯的保留值递减排列，它的保留值仅与疏水作用有关。吡啶、苯酚与4-丁基苯甲酸的保留次序标志了不同柱的选择性。峰拖尾因子大于2.0作拖尾峰列出。由于这些柱的流动相未经优化，拖尾峰并不说明色谱柱不好。选择上述检测溶质的目的是测试色谱柱的性能，反映柱间的差异。 5-2-3-4键合相色谱柱的稳定性 键合相填料的稳定性在方法建立中尤为重要。一旦获得了理想的分离，色谱柱特性应尽可能长时间保持不变，稳定性好的色谱柱可减少重新调整分离条件或更换色谱柱的麻烦。在相同条件下应用时，长链的烷基键合相填料（如C8或 C18）一般比短链的键合相更稳定。图5-10中的数据也表明了这一点。图中一系列非交联型二甲0硅烷改性的固定相，在50%C连续用侵蚀性的0.1%三氟醋酸-乙腈（p H≈2）的梯度进行考察。每一次梯度后，用的0.1%三氟醋酸-乙腈（1：1）混合液等度测定中性溶质1-苯庚烷的k值。图5-10以各有机固定相的% k（k值除以试验开始时的k值）对通过色谱柱的流动相柱体积的函数作图。（注意：15×0.46 cm色谱柱的3000柱体积约相当于4500ml流动相或8小时工作日运行2周。）该图中的% k值与固定相上官能团碳数相关。在本试验中长链的C18与C8配位体明显更稳定（由于键合相流失引起的保留值的变化不大），这是许多用户喜欢用它们的原因之一。随链长度减小，固定相的稳定性也降低，C1（三甲基）相最不稳定。 硅胶基质键合相柱的稳定性（与寿命）与硅胶担体与键合相的类型有直接关系。色谱柱稳定性也很大程度上取决于流动相的p H、所用缓冲液与有机改性剂的种类。硅烷键合相的损失（如图5-10）归咎于将硅烷键合于担体上的Si-O-Si键的水解，在高温、低p H及水比例高的流动相中，离解加剧，而这些又是对许多样品分离较好的条件（见7-3节）。如前提及，交联型键合硅烷固定相可改善或低p H时键合相的稳定性；但色谱柱的重现性可能不理想。 改善硅烷固定相在低p H时稳定性的另一种方法是使用空间保护官能团。如图5-11所示，大体积的硅烷单体能减少通过共价结合于硅胶担体上硅烷的水解。由于连接于硅烷Si原子上的两个异丁基基团的体积较大，每一个Si-O-Si键都被个别保护。在溶液化学中广泛 11 12 尿嘧啶死时间P-嘧啶L-苯酚N-N，N-二甲基苯胺J-甲苯B-4-丁基苯甲酸拖尾峰Adsorbosphere UHS C18BTKromasil C18PLPLNBTT=6.17Adsorbosphere HS C18PLLPPNTAdsorbosil C18BNBT,,BEconosil C18LPBNTPP,N,N,BBAlkima C18PLNBTInertsil ODS-2PLNBTBrownlle Spheri-5 ODSLPBNTP,N,BSpherisorb ODS-2LPBNTPNucleosil C18 ABPLNBTLiChrospher RP-18 endcappedPLNBTPSymmetry C18,150*3.9mmPLNBTLiChrospher RP-18 UnendcappedLPNBTBrownlee Spheri-5 RP-18LBN,PB,BPAdsorbosphere XL ODSPPTLTPN,Zorbax ODSP,BBPLPNBNBT,BYMC ODS-ALNBTKromasil C8PLNBTPartisil ODS-2LNBTAdsorbosphere C18LPBTNPB,NYMC ODS-AQPLNBTExsil ODS 100埃LBTP,BUltrasphere IP PLPNNTBPNucleosil C18 PL,BPLNBTUltrasphere ODS NBP,BPLBTZorbax SB-C18 NPLNBTSymmetry C18, 150*3.9mm TLiChrosorb RP-18PLNBPLiChrosorb RP Select B PLBTTBInertsil C18 PLNNBTBrownlee Spheri-5RP-8LPLNNBTSpherisorb ODS-B PTB=12.4P,BVersapack C18 LBPPNPBNBT,BHypersil BDS C18 LSupeicosil LC-18-DB PLTNTBBPartisil ODS -3PLPBLNBNBTZorbax Rx-C18TUltrasphere Octyl PLNBTP,BExsil ODS-1LPNTBBPartisphere C18 PLNBTP,BEconosil C8 PLNBTAdsorbosil C8 PPLNBT,BPAlltima C8 P,BLLNBTEconosphere C18BNP,N,BPLPLPTSpherisorb Ociyi BNTPNova-Pak C18BNTP,BatphaBond C18,300*3.9mm PLNBTSynChropak RPP-100(C18)PLNBTHypersil ODS C18LPBN,NBP,BPartisil C18 PLNBTTP,BuBondapak C18, 300*3.9mm PLTLNBAdsorbosphere Xl Octyl PPPLNBT,BZorbax SB -C8 PNBBNTSpherisorb ODS -1LTVydac 201HS ,C18 PPLLNNBBTTBHypersil BDS C18 Exsil Octyl 100埃PNucleosil C18LP,BLLPBNBHypersil MOS-2 C8NTTHypersil MOS-1 C8LBBNTTPP=4.56P,N,BP,N,BAdsorbosphere C8LPBTSuplex Pkb-100PLNTNBP,NEconosphere C8LPBNTP,Spherisorb Wide Pore C18PLNTBPN,Nucleosil 300埃 C18P,LiChrosorb RP-8PLPNB,BBBLBTLPNNNBBTYMC BasicPLTTNucleosil 300埃 C8P,BExsil ODS 300PPLLNBNBTAdsorbosphere XL ODS 300TAdsorbosphere XL ODS-BLPNTB=7.80Exsil ODS -BLPNTB=7.80BBPartisil ODSLPBNTPVydac 218TP ,C18 PLBNTSynChropak RP-P(C18,300埃)PLLLNBTSynChropak SCD-100Macrosphere C18PPNNBTPLNBTTBHypersil WP MOS C8P,BBVydac 201TP ,C18 PLDeltabond ODSMacrosphere C8PLNBNBTPPLPLNBTNTTBAdsorbosphere XL Octyl 300BExsil Octyl 300Vydac 208TP ,C8 PPLLNPLNBBTPLNTExsil Octyl-BNTB=6.51BAdsorbosphere XL Octyl-BTB=6.51B00.511.522.533.544.5容量因子 （min）0.991.161.211.221.221.211.261.141.131.211.280.871.311.161.111.181.361.291.311.211.421.181.191.411.191.190.931.431.31.411.241.211.041.331.361.451.151.291.271.281.41.41.321.31.261.152.291.421.371.482.311.271.311.311.431.411.311.491.411.441.341.411.41.741.651.641.721.631.631.631.351.351.61.551.61.741.641.531.671.691.711.721.721.521.611.52 12 13 图5-9 C18 与C8色谱柱的保留值、选择性与峰形。 色谱柱：除了Alphabond与μBondapak C18为30×0.39 cm，Symmetry C18与 C8为15×0.39 cm以外；流动相：乙腈-0.05M磷酸钾缓冲液，p H3.2（65：35）；流速：1.0ml/min；UV检测器，254nm；1 尿嘧啶；2 吡啶；3 苯酚；4 N，N-二甲基苯胺；5 4-丁基苯甲酸；6 甲苯。 100Si-（Me）2C1880Si-（Me）2C8k%6040Si-（Me）2PrCNSi-（Me）2nBuSi-（Me）2Me0010002000020Si-（Me）2iPr4000500060003000柱体积 图5-10 p H2；50C时，硅烷链长度对键合相稳定性的影响。 色谱柱：，15×0.46 cm；试验：0.1%三氟醋酸——梯度，80min梯度，0→100%；流速：1.0ml/min；测定：50%乙腈-水含1%三氟醋酸，1-苯基庚烷的k。 应用的空间保护官能团概念已扩展至色谱填料的表面。如表5-6的数据所示，因为空间保护硅烷基团的立体容积（如二异丙基、二异丁基），以此方法制得的填料比常规的二甲基取代的键合相的含碳量少（表面覆盖率低），保留值小。 有空间保护的硅胶基质固定相稳定性高，其说明见图5-12。图中比较了在强侵蚀条件下测试的不同C18商品柱填料。用8和30 nm孔径硅胶担体制得的二异丁基C18柱，在用27000倍以上柱体积的甲醇-1%三氟醋酸（p H≈0.9）的流动相于900C冲洗后，甲苯的相对保留值基本上无变化。空间保护的固定相对短碳链硅烷特别有用，过去的稳定性则较差（见图5-10），易水解。图5-13比较了（二甲基-与二异丁基-）取代的3-氰丙基硅烷（CN）键合硅烷的稳定性（p H2.0，500C）。空间保护键合相的高度稳定使其非常适用于肽与蛋白质等生物制品的稳定与重现分离（见11-2节）。对于这些分离，流动相通常保持低p H（一般p H≈2），在高温下进行这类试验往往最好。 尽管大多数分离在低p H下进行最好（p H≤3；见第5章），但也有些分离在高p H进行，因为： 1有关化合物在低p H时不稳定。 2在低p H时，达不到所需选择性（而且必须使用p H的变化）。 3溶质化的（亲水的）碱性化合物在低p H时，保留太小。 如前提及，由于硅胶担体的快速溶解和由此产生的色谱柱床塌陷，有些硅胶基质的色谱柱不应在p H>8时使用。用高p H流动相的研究表明，在硅胶担体上连接有硅烷的Si-O-Si基团受破坏较慢。确切地说，硅烷键合相在高p H流动相的流失显然是由硅胶担体的溶解而引起。这样，键合的硅胶被破坏是从基质开始的，最终从其表面剥离下来。 13 14 CH3O未保护键合相SiCH3C18OH空间保护硅烷延缓水解OHCH3CH3CH2CHOSiC18CH3空间保护键合相CH3CH2CHCH2CH3OSiCH3C18OSiC18CH2 图5-11 硅烷键合相的Si-O-Si键的水解 1.21.0相对保留值（甲苯）1.21.00.80.60.4二异丁基-C18（8nm孔径）二异丁基-C18（30nm孔径）二甲基-C18色谱柱A二甲基-C18色谱柱B二甲基-C18色谱柱C0.80.60.40.20.000.20.030000 01000020000冲洗的柱体积图5-12 p H、高温时，硅烷键合相降解 色谱柱：，15×0.46 cm；流动相：50%甲醇-水+0.1%三氟醋酸（p H≈0.9）流速：1.0ml/min；90C；用如图5-10中的甲苯进行试验。 其它研究认为，色谱柱在高p H降解很大程度上取决于硅胶担体的类型与硅烷固定相的性质。比如，图5-14的数据表明致密键合到某些高纯度硅胶上的二甲基- C18相（图中空心符号），在p H9显示异常稳定，以柱效的变化（塔板高度）作指标。（由于在高p H时键合相上的k值随使用仅很慢地减小，用保留值衡量柱稳定性欠准确，而塔板高度与峰对称性是较好的指标。）图5-14与其它报告中的数据表明，经硅胶-凝胶工艺制得的硅胶担体（即硅 14 015 溶胶交联），可用于某些高达p H9的流动相。假如用有机缓冲液并维持在<40C操作时，溶胶凝胶硅胶上的完全反应的、封尾的烷基键合相柱日常应用p H至少可高达11。然而，用凝胶硅酸盐工艺（凝胶化的可溶性硅酸盐-图5-14中的实心符号）制得的硅胶填料降解很快。 5二异丙基-氰基二甲丙咪嗪的K值4先%C为4.16后%C为3.93二甲基-氰基3先%C为1.43后%C为1.04201020时间/h图5-13短链氰基键合相的稳定性比较 色谱柱：15×0.4 6cm ；流动相：乙腈-0.1%三氟醋酸（28：72），以三乙胺调节p H至2.0；流速：1.0ml/min；50C。 0304050 柱填料封尾可减少硅胶基质色谱柱在中等与高p H下的降解。很明显，用小分子封尾硅烷与硅羟基加成反应产生了疏水隔层，能有效延缓硅胶担体的溶解。图5-15表明一种强碱性药物曲米帕明的k值增加情况，封尾的C18柱与类似的未封尾的C8柱均用强侵蚀性p H70的磷酸盐流动相在60C冲洗时，前者k值的增加慢得多。这些结果表明硅胶担体表面由于被该流动相溶解而露出的酸性硅羟基可使碱性药物保留增加。封尾色谱柱上的封尾基团抑制了这种不良效果。 硅胶基质的色谱柱在中等与高p H下的降解速率，受所用流动相与操作温度的影响也很大。因此，应采取措施降低键合相柱的硅胶担体的溶解速率。对硅胶担体在中等与高p H时的溶解与色谱柱稳定性的系统研究表明，建立p H7或以上的普适性好的HPLC方法，应遵循表5-7中的原则。 尽管需进一步深入研究更好地限度硅胶基质色谱柱在高p H下的操作条件和限度，现在已明确（利用以上所列条件）某些硅胶基质的色谱柱日常能用于p H9，甚至更高。图5-16表明硅胶基质的C18键合相柱，用硼酸盐或甘氨酸（氨基乙酸）缓冲液（或其它有机基质的缓冲液），而不是常用的碳酸盐与磷酸盐缓冲液时，溶解度会有所降低（且寿命增加）。通过硅溶胶交联制得的硅胶担体柱（Hypersil、Kromasil、Spherisorb、Zorbax），在中等与高p H时，比那些采用干凝胶类型的（硅酸盐凝胶）传统色谱硅胶柱的要稳定得多。 假使使用适宜的操作条件，在溶胶型硅胶基质上通过致密键合的与仔细封尾制得的烷基键合柱，通常可在至少p H11时使用。高p H条件有利于分离碱性化合物，是由于它们为游离与非离子状态。而且，在高p H时硅胶基质表面未反应的硅羟基完全电离，表面作用很弱， 15 16 而在中等p H值时，表面硅羟基仅能部分离子化。但在高p H条件下使用硅胶基质柱时，必须用适当的操作条件，以尽量减少硅胶担体的溶解： 0.0030.00250.0020.0030.00250.002Zorbax Rx-C18k‘=4.3Novapak C18k‘=4.1塔板高度0.00150.0010.000505000Hypersil ODSk‘=4.30.00150.0010.0005100001500020000250003000035000Zorbax Rx-C18k‘=4.3冲洗的流动相体积（色谱柱体积倍数） 图5-14 p H9 时，C18柱的稳定性 色谱柱：15×0.4 6cm ；流动相：乙腈-0.01M磷酸盐p H9.0， （1：1），溶质：N，N`-二甲基苯胺；流速：1.0ml/min；22C。 010未封尾已封尾9三甲丙咪嗪的k’值5876050015002500200010003000冲洗的体积（色谱柱体积倍数）图5-15未封尾与封尾C8柱的稳定性比较 3500 色谱柱：15×0.4 6cm ，二甲基-C8与双封尾的二甲基C8（Zorbax XDB-C8）；冲洗：甲醇-0.25M磷酸钠缓冲液p H7.0， （20：80）；60C；1.0ml/min；试验：乙腈-0.01M磷酸钠缓冲液p H7.0， （60：40）；0 16 流速：1.0ml/min；40C。 017 表5-7在p H7以上，建立普适性方法的策略 用键合致密（完全反应）的长链烷基固定相（C18 、C8等） 用以硅溶胶工艺制得的硅胶担体（Hypersil、Kromasil、Spherisorb、Zorbax），以减少硅胶担体的降解。 用有机的、枸橼酸与硼酸缓冲液，以减少硅胶担体的溶解（如可能，避免用磷酸盐、胺盐与碳酸盐）。 保持0.01~0.05M的缓冲液浓度。 设定柱温≤400C。 为使色谱柱稳定，用缓冲阳离子Li+>Na+>K+>NH4+。 为使色谱柱稳定，用经封尾的色谱柱。 加碱性流动相改性剂（如三乙胺），以保持良好的长期分离重现性。 180160140磷酸盐碳酸盐硼酸盐甘氨酸溶解的硅胶量mg120100806040200024681012141618 洗脱剂体积（升）图5-16 p H10阴离子缓冲液对硅胶担体溶解度的影响 色谱柱：Zorbax Rx-C18，15×0.4 6cm；连续非循环冲洗：甲醇-0.1M缓冲液p H10，（50：50）；流速：1.0ml/min；25C。溶解的硅胶用硅钼酸盐的颜色反应指示。 01用溶胶-凝胶法制备的低溶解度担体 2用致密键合、完全封尾的长链烷基配位体的填料 3用有机或硼酸盐缓冲液（而不用磷酸盐或碳酸盐！） 04操作温度≤40C 图5-17a所示为强碱性药物β-阻滞剂（pKa=9.5~9.7）的混合物的初始分离，用致密键合与封尾的C8柱以及上述的条件。图5-17b表明用相同色谱柱，经约31000倍柱体积的p H11流动相的情况（每天8小时计，约运行3个月）。甚至在高p H条件下，该硅胶基质色谱柱对常规操作也显示出极好的峰形、高柱效、以及足够的稳定性。然而，应注意在p H值8以上操作时，硅胶基质色谱柱的寿命一般较短。 5-2-4保留值与选择性变化的原因 官能团相同（如C18、 C8等），由键合相色谱柱的不同引起保留值与选择性变化的原因有： 1硅胶担体不同 2硅烷的选择：单官能团或多官能团 17 18 3键合的彻底性：部分或完全反应 4是否封尾 5键合化学 6担体表面积 （a）吲哚洛尔氧烯洛尔开始时丙泮洛尔t0美托洛尔N=7500As=0.99（b）31284倍柱体积之后N=6600As=1.37024681012141618保留时间（min）202224 图5-17硅胶基质键合相柱在p H11时的稳定性 色谱柱：15×0.4 6cm ，双封尾的二甲基-C8（Zorbax XDB-C8）；流动相：甲醇-0.05M盐酸 1-甲基哌啶p H11.0， （55：45）；流速：1.0ml/min；24C；UV检测器，215nm；样品：吲哚洛尔，美托洛尔，氧烯洛尔与丙绊洛尔，pKa=9.5~9.7（浓度分别为0.165，0.413，0.413与0.083mg/ml）；进样：5μl。 0这些因素中每一个都能使最终的HPLC方法变得重现性不好。由于硅胶担体的不同，引起的保留值与选择性变化在本章的前部分中已作讨论。例如，表面积不同能引起保留值的变化，担体的表面积增加，有机固定相的量与保留值提高。硅胶担体表面上硅羟基类型及浓度的差异，能引起保留值，尤其是选择性的不同。用由酸性弱、纯度高（B型）的硅胶担体制得的色谱柱分离碱性化合物，批次之间的变化并不大，甚至用不同生产厂家的色谱柱时，情况也是如此。任何情况下，在规定的色谱柱上建立的方法，都应该用至少两个其它批次柱进行证实（论证）后，才可采用（见15-9节）。不同厂家的同种色谱柱（如C18）很少得到相同的分离。 用单官能团硅烷制得的色谱柱的分离，批次之间的重现性好于由多官能团硅烷制得的柱。完全反应的（致密键合）填料比部分反应（低硅烷浓度）表面的填料的重现性好，更稳定。（部分反应的担体，当覆盖率明显低于表5-6中的数值时，通常能加以鉴别）。完全与部分反应的同一键合相（如C18）填料，也会发生明显的选择性差异。已封尾的填料之间，由 18 19 于被分离的样品特殊，可见到选择性与峰形状的差异。最后，硅烷化反应条件的不同能引起不同生产厂家键合相相似的填料之间，保留值不同。对于方法建立，许多使用者更喜欢使用反应完全的、单官能团硅烷键合相填料。具有不同官能团的柱填料在表5-8中加以概述，另有可用于方法建立的说明。 表5-8HPLC中有用的柱填料a 方法 反相（与离子对）方法 C18（十八烷基或ODS） C8（辛基） C3、 C4 C1[三甲基硅烷，（TMS）] 苯基，苯乙基 CN（氰基） NH2（氨基） 聚苯乙烯基b 正相方法 CN（氰基） OH（二醇基） NH2（氨基） 硅胶b 尺寸排阻方法 硅胶b 硅烷化硅胶 OH（二醇基） 聚苯乙烯基b 离子交换方法 键合相 聚苯乙烯基b 评论 普适性好；保留性强；用途广 与C18相似，但保留值稍小 保留值小；大多用于肽类与蛋白质 保留值最小；最不稳定 保留值适中；选择性有所不同 保留值适中；正相与反相均可使用 保留性弱；用于烃类；欠稳定 在1< p H <13的流动相中稳定；对某些分离峰形好，柱寿命长 普适性好；极性适中；用途广 极性大于CN 极性大，欠稳定 普适性极好；廉价；操作欠方便；用于制备LC 普适性极好；作吸附剂用 吸附性弱，溶剂兼容性好；适用于有机溶剂 欠稳定；在水SEC中使用（凝胶过滤） 广泛用于有机SEC（凝胶渗透）；一般与水和极性大的有机溶剂不相容 稳定性与重现性均不好 柱效不高；稳定；重现性好 a除另有说明，均为硅胶基质键合相 b此类填料为非键合相 5-3色谱柱的性能指标 使用色谱柱的类型和构型（粒度、长度、内径等）通常由分离的要求决定。在2-3-3节中，我们讨论了不同长度与粒度的色谱柱的价值。对一指定类型的色谱柱，可能会有许多供应商；然而，这些色谱柱的性能会相差很大。因此，方法建立与以后的日常分离中，需用有关色谱柱规格与性能的某些信息，色谱柱的有关要求包括： 某指定k值的塔板数N 峰不对称因子（As） 两种不同溶质的选择性（α） 色谱柱的反压 保留值（k）的重现性 键合相浓度（是否合适） 色谱柱的稳定性 如可能，在购买色谱柱之前，应从柱生产厂家获悉这些资料。许多生产厂可为每支柱提 19 20 供上述前4项数据，包括每支柱的测试色谱图。有的生产厂还提供有关保留值重现性的数据。键合相浓度与柱稳定性的数据一般没有，但在科学刊物中可能会看到某些色谱柱的数据。有些供应商对他们的色谱柱提供担保（如60天），以使用户确信其性能与寿命水平。 5-3-1理论塔板数 塔板数（N）是色谱柱的一个重要特性。N定义为产生尖锐、窄谱峰，以及小α值时色谱峰达到良好分离度的能力。色谱柱塔板数在2-3-3节中已作讨论。表5-9表明了填充良好的各种长度与粒度的HPLC色谱柱的典型塔板数（小分子中性样品，MW≈200）。注意，这些值是在最佳条件下——低黏度流动相与0.5~2.0ml/min的流速下获得的。下式能用于估计在这些优化条件下，小分子的柱塔板数： N≈[3500L（cm）]/ dP（μm） （5-1） 式中L为柱长， dp为微粒的直径。 表5-9在最佳测试条件下，填充良好的HPLC色谱柱的塔板数 微粒直径（μm） 柱长（cm） 塔板数（N） 10 10 5 5 5 3 3 3 3 15 25 10 15 25 5 7.5 10 15 6000~7000 8000~10000 7000~9000 10000~12000 17000~20000 6000~7000 9000~11000 12000~14000 17000~20000 大多数生产厂家表明他们测定N的条件，色谱柱出现问题时，可重复该实验。如果一支新柱的塔板数就很低（N<80%声明值），一旦排除仪器问题的可能后，应将柱退回生产厂家，要求退换或退款。仪器与有关的柱外问题，一般极短柱或细径柱较常见，会使柱塔板数低于期望值。 对于现有HPLC方法，新柱的塔板数常用特定的样品化合物，用标准（规定的）分离条件进行测定。由于色谱柱塔板数取决于具体的实验条件，所以具体测定化合物的塔板数可能会小于在优化条件下测定的中性小分子溶质的最佳值。当溶质分子较大或流动相的黏度较高时，N值可能仅为最佳值的一半或三分之一。有些溶质的二次保留（由于硅羟基作用）也能引起峰展宽与塔板数小于期望值。应预先考虑可能出现的问题，相应地选择适宜的色谱柱与流动相。如果在方法建立之中，能发现硅羟基所致的副作用，应尽早采取改进措施。如7-3节中所讨论，应用一定的色谱柱另加一定的流动相改进剂，往往能纠正这类问题。 有些用户保存N值对时间或所测化合物进样次数的系统记录，便能随时了解柱效的情况。该记录有助于操作者监测柱性能与预测何时需维修（或更换）色谱柱。N值与使用过程测量值的记录对判断特定生产厂家的色谱柱的整体性能也很有用。 见9-1-1-2节所讨论，方法建立之初用15或25 cm、5μm微粒的色谱柱较好。该构型对大多数分离有足够大的N值，而且这类柱相当可靠。开始阶段时用大N值色谱柱的突出优点是易于辨认出紧密重叠的峰。如果特殊的分离需要大N值，可用小体积的接头连接其它柱，以增加柱的长度。 3μm微粒的短柱对于快速分离很有用（如<5 min）。然而，微粒小于3μm的色谱柱往往不适于日常应用，由于它们（1）易受样品的影响，（2）对操作者的依赖性大，（3）更易受仪器谱峰展宽的影响。但如前提及（5-2-2节），有研究表明，使用大小均一、3.5μm的微粒对减少这类问题，是一个实用的选择。图5-18所示为用3.5μm微粒柱的快速分离的一 20 21 个示例。用这种分离系统，以高流动相流速，快速分离大分子酸性抗生素时，可得到很好的塔板数与对称谱峰。 11、头孢噻甲羧肟2、头孢氨噻3、环丙沙星4、头孢唑啉2检测器响应N=6200As=1.09N=6350As=0.924N=5790As=1.002.53300.511.52保留时间（min） 图5-18抗生素的快速分离 色谱柱：8.0×0.4 6cm Zorbax SB-C8（3.5μm）；流动相：乙腈-0.1%三氟醋酸 （8：92）；流速：3ml/min；样品：1μl中含有1~4方别为0.4、0.36、0.10、0.35μg； 60C；260nm检测。 05-3-2峰不对称与拖尾 柱塔板数对衡量色谱柱的质量极为有用，峰形在方法建立中也同等重要。色谱柱与实验条件如能给出对称峰，总是受青睐的。峰不对称能导致： 1塔板数与分离度测定不准 2定量不准确 3分离度降低与峰尾中的小峰检不出 4保留值的重现性不好 实际工作中用峰不对称因子，As，表示峰形，计算如图5-19。峰不对称性在整个峰高的10%处进行测定。理想柱的峰Ass值为0.95~1.1（绝对的对称峰为As=1.0）。为准确测定对称性，谱峰应用放大的时间刻度测定。在压缩（长时间刻度）色谱图中观察不对称谱峰时，往往显得对称。 图5-20所示为不同As值谱峰的形状与宽度结果。生产厂家有时规定新柱的Ass值为0.95~1.3。被测样品Ass值一般应<1.5。图5-18是峰As值约为1.0的抗生素药的分离图。另一个定义峰形的有用方式是用峰拖尾因子（PTF），其计算如图5-19所示。有些机构，象美国药典，用此方式规定峰的对称性。此方法在全峰高的5%处计算。峰不对称因子与峰拖尾因子的相互换算很容易，如表5-10所示。 5-3-3色谱柱失效：色谱柱寿命应有多长？ 制作良好的色谱柱的稳定性与使用寿命，取决于操作者对色谱柱的使用与处理。所有色谱柱最终必然“失效”。当柱不再能保证特殊样品所需的性能时，则应更换新柱。如果塔板数下降50%，或分离度约降至原值的四分之三（如从2.0降至1.5），可能需更换新柱。一支性能有所降低的色谱柱，对某种分析可能仍然有用。峰不对称值As增大至>1.5，也可能是更换新柱的信号。尽管本章后面描述的技术可用于性能下降色谱柱的复原，但许多实验室却不愿试图再生处理低性能的色谱柱。如急需得到分离结果，往往必须更换新柱，以便尽可能快地恢复分析。 21 22 峰不对称因子=B/A峰拖尾因子=（A+B）/2AA10%峰高B{时间}5%峰高 图5-19测定峰不对称因子与峰拖尾因子 表5-10峰不对称因子与峰拖尾因子的关系 峰不对称因子（10%峰高） 峰拖尾因子（5%峰高） 1.0 1.3 1.6 1.9 2.2 2.5 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 很好可以不可以太差 图5-20不同不对称因子值的峰形状 色谱柱使用多长时间应更换，与注入样品的类型关系很大。一般干净样品，每支色谱柱正常分析次数为1000~2000次。干净样品即为匀质溶液，其成分在每次样品进样之间应能完全流出色谱柱（如按配方配制的样品、药品或反应中间体）。然而，前几节讨论的注意事项必须严格遵循。对于干净样品，一次分析的柱价格大约为（美圆）0.20，仅相当于总价格的1%。对更复杂和脏样品，或那些临界分析条件的样品，每柱的正常分析次数为200~500。这样，一次分析的柱价格约为（美圆）1，约相当于总价格的4%。而对来自生物或极为复 22 23 杂的物质（如肝脏提取物、富含有机物的土壤等），每柱的分析次数为50~200。这种情况，一次分析的柱价格约为（美圆）3，约相当于总价格的10%。由于一次分析的柱价格较低，在使用建立的方法时，一般总应储存一支高效、性能好的色谱柱，以能适时地提供高质量的结果。 注意一次分析的色谱柱低价格，结合样品预处理的高价格（滤过、提取等；见第5章），可能使某些样品的预处理步骤显得过于浪费。在那些情况下，减少样品的预处理，接受色谱柱的短寿命可能更合算。预处理步骤还会降低分离精度，有时不适于日常的实验室工作。当然，在其它分离目的中，不应仅因为柱价格而使分离受到损害。许多实验室由于柱价格与不易知道何时该更换保护柱以及它们的价格，也不使用保护柱。为延长色谱柱的寿命，有些实验室在色谱柱进口处加装特殊设计的小体积预柱滤器，以滤去颗粒。然而，这些装置必须定期地更换，以防堵塞。因此是否应对样品预处理，取决于样品自身以及分析的目的。第4章可帮助决定在分析分离之前是否进行样品预处理，对具体样品哪种方法最好。 5-3-4保留值的重现性 不同色谱柱之间的保留时间或K值的重现性，可通过测定一系列的标准品来决定，最好极性与非极性的分子都包括。色谱柱厂家往往通过一个试验，评价原色谱柱的性能。在用户实验室中可定期地重复该试验，以确定不同色谱柱之间的保留性能或应用期间每支柱的性能。有时，用户以一个有关化合物（如药物）进行鉴别则更实际，用该化合物以及典型的操作条件观察保留的重现性。当用标准条件操作时，测试化合物的保留时间（或k值）应极为接近。如果分离设计得合适，数据记录得恰当，应用系统适用性试验（15-11节），可为日常分析提供这些数据。 同一生产厂的色谱柱的长期重现性对建立一个普适性强、重现性好的方法是一个重要因素。多个生产厂现在声明它们的键合相柱能长期稳定。比如，图5-21所示为某商品C18柱四年期间的生产重现性。用甲苯（中性）与N，N-二甲基苯胺（碱性）k值的恒定与微小变化说明在此期间硅胶担体表面积的变化。在这段生产期间，这两种溶质的选择性（α）保持恒定是重要的要求。能提供这种信息的生产厂家不多，所以，如需要，用户必须自己进行这类试验。 5-3-5压力降 当使用的操作条件、色谱柱尺寸和微粒粒度相同时，填充良好的色谱柱的渗透性或反压力也应该相似。用球状微粒填充的色谱柱的压力降可用下式估算： P=3000×L×η/（dp2×t0） （5-2） 式中P为压力（psi），L为柱长（cm），η为流动相的黏度（cp）， t0为色谱柱的死时间（min），dp为微粒的直径（μm）。新的球状微粒柱的压力降不得超过式5-2预测结果的30%。用不规则微粒填充的色谱柱压力可能会高些。供应商报告的反压力一般是在特定操作条件下测试的结果。 5-3-6键合相浓度（覆盖率） 制作良好的硅胶键合相是在硅胶担体表面致密覆盖有机基团。实际覆盖率取决于有机配位体的大小：由于空间阻碍，硅烷基团如果较大，则难以达到较高的表面浓度。完全（致密）键合填料的表面浓度（每平方米填料表面键合相的微摩尔数）随烷基基团而不同，相当于表5-6中的数值。反应致密、有空间保护基团的填料，由于大体积保护基团的空间位阻，其硅2烷基团的浓度较低（1.9~2.2μmol/m）。如表5-6中所示，用表面完全反应的色谱柱填料，可能会得到较好的柱间保留重现性和柱寿命。 5-4色谱柱问题与解决方案 色谱柱在使用中往往出现一些问题。在本节中，我们考虑如何辨认这些问题，并着手解 23 24 决它们，以使方法建立卓有成效。现在讨论HPLC方法建立中的三种最重要的问题：（1）保留值与分离度发生变化（2）谱峰拖尾（3）色谱柱的寿命短。 54DMA k：平均2.38；标准偏差3.7%3k值Toluene k：平均2.95；标准偏差3.8%2Alpha，Toluene/DMA：平均1.24；标准偏差0.48%101234567891011121314 产品批号图5-21 1990~1994生产的单体硅烷键合相柱Zorbax Rx-C18四年间的重现性 色谱柱：15×0.4 6cm；流动相：乙腈-0.1Mm NaH2PO4 （50：50）；流速：1.6ml/min；试验溶液：N，N-二甲基苯胺与甲苯 5-4-1保留值与分离度重现性不好 当建立常规方法时，色谱图中峰的保留值与分离度的重现性极为重要。如果每次分析的样品保留值不能重现，则不能肯定改变条件会使分离改善。因此，方法建立期间每天应至少用与此目的有关的特别条件，检查一次色谱柱保留值，这很重要。整个过程中，k与α值的变化不应超过2~3%。分离度的变化（由k、N或α的变化引起的）与下面变化有关：（1）色谱柱与其操作条件，（2）仪器影响，（3）分离条件。表5-11总结了在HPLC中可能发生的保留值与分离度变化的类型，以及每种变化的原因。 表5-11 HPLC中保留值与分离度的变化 结果 柱间差异 使用期间柱变化 原因 担体、键合的不同 柱床扰乱 键合相丢失 硅胶担体溶解 非流出物质堆积堵塞 柱外效应 系统间： 进样量大；进样阀与色谱柱之间和/或色谱柱与检测器之间的管线体积大；检测器体积大；接头体积大； 也可由各种化学作用而引起，包括流动相/固定相组合与样品之间的不匹配； 分离控制不好 流动相组分改变 流速改变 温度改变 K，a N a K， a， N a 24 主要变化 K、α N K、α N K、N N K，a K，N 25 柱平衡慢 柱超载 a再平衡时间不足 样品质量太大 N值的变化通常很小。 色谱柱在使用中必须保持恒定的保留值与可接受的分离度，否则，不能保证方法的准确度与精密度，需经常换新色谱柱。有时新柱会给出不同的分离结果（不能令人满意）。这意味着该方法的操作条件必须加以改进，以恢复所需分离。建立的方法往往需传递至其它的实验室，在那里需用面值相当的色谱柱，以获得可接受的结果。因此，操作者应当留心色谱柱重现性不好的原因。处理这一问题的实用方法讨论如下。 保留值的重现性可能是建立良好HPLC方法的主要问题。解决有关重现性不好的问题，通常有以下几点： 1开始时选一支好色谱柱，其担体（如为硅胶基质）酸性弱、纯度高，整个应用中都使用同一固定相、粒度及柱尺寸。 2用良好的流动相条件（p H、缓冲液种类及浓度、添加剂等），尽量减小硅胶基质柱的“化学”或“硅羟基效应”。 3确保用流动相充分地平衡色谱柱（见9-1-1-5节）。 4用适宜的实验室技术，确保日间操作的稳定性。 5如需要，用保留值图能进行正确的修正（见10-6节）。 6预存色谱柱，或联系能连续提供同种柱的地方。或者，测试多批色谱柱，以保证所选的特别柱能用于最终方法。 如前所述，不同生产厂的同类型柱（如C18），往往在保留值与分离度方面有显著差异，这些差异是由硅胶基质和键合化学的不同而引起。所以，不同厂家的色谱柱一般不能通用。图5-22所示为两支不同厂家的C18柱对一植物激素混合物截然不同的分离。用X公司的C18柱的分离结果往往显著不同于Y公司的C18柱。这一般由于所用硅胶担体的不同而造成。 如5-1节中所讨论与图5-9与5-22的说明，由于不同的化学（硅羟基与其它）作用，柱间的保留值会出现差异。对碱性样品，可用一些分离参数尽量减小这些差异，它们包括： 1用酸性弱、纯度高的硅胶担体（表5-4） 2 用p H≤3的流动相（反相） 3缓冲液浓度≥20mM（K+较好，因为其溶解度好，抑制不良硅羟基作用的能力强） 开始时，应使流动相尽量简单，以使重现性好、柱平衡快。如峰拖尾或峰形不好，那么操作者可有以下选择： 1在流动相中，加入30 mM的三乙胺（用于碱性化合物）或醋酸胺（用于酸性化合物），未知化合物加醋酸三乙胺。 2如仍然拖尾，将三乙胺换成二甲基辛胺（或醋酸二甲基辛胺） 3降低进样量至<1μg 实际上，以上步骤提供了一支“通用柱”的条件，它可减小不同厂家生产的键合相柱分离碱性化合物的差异。有研究表明，用非酸性色谱柱，在低p H流动相条件下，碱性化合物在不同批次的色谱柱上有不同的保留值，但这种差异通过在流动相中加三乙胺，可减小到可接受的程度。7-3-3-2节详细讨论了分离离子或可电离化合物的最佳条件，请参阅。 在缓冲不正确的流动相中，往往发生保留值重现性不好与峰拖尾的现象，也就是说，缓冲液选择不对（7-2-2节）、缓冲液浓度太低或已超出有效的p H缓冲范围（不应超出可电离缓冲液成分的pKa1个p H单位！）。增大缓冲液浓度（或减小进样量），通常能改善这种情况。应用流动相改进剂降低硅羟基作用的讨论（见7-3-3-2节）。 在实验条件控制不好的情况下，保留值与分离度往往发生变化。改变流动相能引起日内 25 26 或日间色谱图的变化。人工配制流动相时应在同一温度下，用溶剂仔细混合（称重最为准确）。在线混合溶剂的仪器常可减少出错成分。然而，结果出乎意外时，应人工核查仪器混合的准确度。一些低压混合装置的比例阀易出故障，特别当使用高浓度缓冲液时。而且，当任一种输入溶剂低于10%时，在线混合的准确度则不如人工配制的流动相。如怀疑流动相组成有误，应仔细新配一次流动相，并重复该分离。应该用人工配制的溶剂核对可疑的在线混合溶剂。 ZRIAAABAIAAABAZOGZRZZZOG0481216202428(a)0481216202428(b) 图5-22 HPLC不同键合相柱的选择性差异：反相梯度洗脱分离植物激素 色谱柱：（a）Hypersil ODS，（b）Spherisorb ODS；流动相梯度：0→50%甲醇-水（p H3.3）。化合物：IAA，吲哚-3-醋酸；Z，玉米素；ZR，玉米素核苷；ABA，脱落酸；ZOG，玉米素-O-糖苷。 由于所选溶剂的蒸发损失，保留值也可发生变化。该现象在流动相除气或放置期间都可发生。注意，不过该问题对反相HPLC不甚重要，除非缓冲剂为挥发性的，如氨和碳酸氢盐。溶剂除气，无论用真空法还是更好的氦驱气法（≈用气体喷散管剧烈搅动5 min），每次都应用相同步骤进行，即使溶剂发生了选择性的挥发，这种方法仍可保证重现性。吸收二氧化碳能使流动相的p H改变，在应用中将氦气缓慢、连续地通过流动相储液器，使其覆盖于储液器液体之上，可使进入的二氧化碳减至最低限度。商品在线溶剂脱气机一般很有效，不过，用这些装置，在用新溶剂平衡系统之前，应充分清洗掉过去残留于管线中的溶剂。 由于仪器故障引起的流速变化会使所有谱峰的保留值发生突变，不同实验中会有随机的峰波动。如果流速发生了变化，检测器基线可能漂移，出现高于正常值的基线噪音。而且，柱进口的反压力波动也比平常值大。由于传感阀问题造成的流速变化也能引起压力波动，对色谱柱性能与寿命均有害。通过测定具体一段时间色谱柱流出液的体积，能够测定流速的准确性（约1%以内），计算出ml/min（例如充满2或5ml容量瓶的时间）。注意，由于该流速测定是一段时间累计的总和，该方法不可能检测出短期的流速变化。 样品质量过大能引起柱超载峰的保留时间和/或N值下降。解决这一问题的通常办法是，凭经验找到使保留时间、塔板数最大的进样量。一般说来，内径约0.46 cm色谱柱的最大样品量为10~50μg；当硅羟基作用为保留过程的主要因素时，不足1μg的碱性样品也可能造 26 27 成柱超载。有种可用方法是以大样品量开始试验（10~50μg，除非造成了检测器超载），然后逐渐减小样品量，直至保留时间恒定为止。 柱温变化是保留值变化的常见原因（见图7-6和11-9）。当分离离子或可电离的化合物0时，情况尤其如此，因α会随温度发生显著变化。如需高精密度，应将色谱柱保温在±0.2C。如没有恒温装置，绝缘包裹的色谱柱也可减少实验室温度变化的影响。用离子对HPLC与RPC分离离子或可电离的化合物时，务必使用能恒温的色谱柱。 尽量减少实验室温度变化，可减少未恒温色谱柱的保留值变化。当用自动进样与自动化操作时，恒温环境对减少柱温变化非常重要。这时，柱温变化会造成保留时间的漂移，一致超出某些自动数据处理系统所需要的窄范围“检测窗”。 在方法应用期间内，如果保留值变化是由色谱柱的变化而引起，可利用对操作条件可预测的改变（溶剂强度、溶剂混合等）恢复至可接受的分离。如果能知道不同操作条件的影响，就能达到这一目的，而不必重新再建立新方法。有关化合物的保留值“图”有助于该项目的实现；见10-3节与图1-5的讨论。在方法建立期间，记录下操作条件微小变化的影响，对分离度下降时作适宜的调整特有价值。 如前提及，同一厂家同类型柱批次间的保留值与选择性也会有显著差异。用一色谱柱建立的特别分离，当再用另一新批号的同类型柱时，分离情况可能不一样。测试一个方法是否运行可靠，最好办法是评价几支不同批次（三支或更多）的色谱柱。所有批次的保留值与选择性的重现性都可接受时，才可认为该方法用于日常应用时有足够的普适性（抗干扰能力）。相关峰的分离至少应达到理想测定所需的最小分离度，应考虑到使用中合理的分离度下降。使用能提供（并担保）高质量，重现性好产品的生产商的色谱柱，可减少重现性问题。当优化流动相不能避免批次间的变化时，一些生产厂可以在数年期间提供相同（大）批号的色谱柱。同一批号的色谱柱应在保留值与色谱性能方面极为相似。 5-4-2谱峰拖尾 应避免使用导致峰拖尾或峰不对称的条件。谱峰拖尾使分离质量和精密度下降（尤其当用自动数据系统时）；柱间重现性不佳也可能与峰拖尾有关（硅羟基作用）。本节中，讨论方法建立中的谱峰拖尾与色谱柱极其使用期限的关系。有关谱峰拖尾的问题与解决办法的全面讨论（见7-3-3-2节）。 当出现拖尾峰时，估算柱塔板数与谱峰分离度时将偏高。拖尾峰可以拖至紧接流出的下一个峰中，使每个峰的定量准确度下降。对于不对称因子为1.2的峰（峰拖尾因子≈1.15），用半高峰宽方法（式2-8a）计算能使塔板数偏高达30%，导致计算分离度的误差高达15%。因此，开始建立需高度精密与长期重现的方法时，人们总是希望得到对称性好的峰。 导致峰不对称或谱峰拖尾的原因有很多，见表5-12中所概括。生产商的初始柱不好（由于填充不好）是不对称峰的一个偶然原因。用中性化合物测试新柱，如显示峰严重不对称，不可用于方法建立。在排除了是系统问题的可能后，这样的色谱柱应退回生产厂家，要求更换。 表5-12不对称（拖尾）峰的原因 色谱柱不好；堵塞筛板或有凹陷 “污物”在柱进口处积聚 样品超载 样品的溶剂不对 柱外效应 化学或二次保留（硅羟基）效应 缓冲不足或不合适 重金属污染 27 28 拖尾峰常见于使用过度的色谱柱。使用期间，色谱柱可产生严重的峰拖尾（图5-23a）或甚至每个组分出现双峰（图5-23b）这种结果通常由柱进口处出现了塌陷和/或赃物，部分堵塞进口滤板而造成。有关堵塞进口滤板的问题可仔细更换色谱柱进口滤板（勿搅动填料！），加以解决。由于柱进口产生塌陷引起的问题，有时可再用同一种填料填补进柱塌陷处而解决。然而，用此法不易恢复或保持色谱柱的初始性能，尽管反向冲洗色谱柱也有效。填补柱塌陷对价格高的色谱柱最实用（如手性柱或制备柱）。其它情况，该法应该仅在紧急情况时用或作为最后的手段。 应用期间，出现宽的拖尾峰（如图5-23）也说明在柱进口处有强保留的样品组分（“垃圾”）积聚。消除这种情况，有时能用强溶剂彻底冲洗色谱柱。用20倍柱体积（15×0.46 cm的色谱柱，约30ml）的96%二氯甲烷与4%甲醇，加1%氢氧化铵混合液冲洗，对反相柱往往有效；正相柱可用甲醇。在困难情况下，可能有必要用强溶剂以小流速反向冲洗色谱柱。在建立常规方法时，用保护柱是减少强保留样品组分积聚可能性的有效方法，如5-4-3-2节中所讨论。有些方法也需要有效的预处理步骤（见第4章）。 严重拖尾每个组分出双峰(a)(b) 图5-23 色谱柱问题的一些症状 如图5-24所示，注入的样品溶剂强度大于流动相时，往往会造成早流出的谱峰变形和拖尾。在本例中，注入纯乙腈为溶剂的样品与以适宜的18%乙腈-水流动相作溶剂的样品进行分离比较，前者为不对称宽谱峰。当样品难容于流动相时（或弱溶剂），可取小体积的强溶剂进样（如0.46 cmID色谱柱，<25μL）。不过，有可能发生峰形差、样品沉淀、柱堵塞和定量不准确。对难容的物质，用强溶剂溶解样品后，再用等体积的流动相稀释，往往能成功地进样。 与HPLC设备有关的柱外效应可引起峰拖尾与谱峰展宽。这些与谱峰扩散效应有关的因素有：（1）进样的体积过大，（2）进样阀、色谱柱及检测器之间的管线体积过大，（3）检测器流通池的体积过大。如2-3-3-3节所讨论，所有这些效应的叠加，加剧了峰拖尾，并降低了表观柱效。这种拖尾对那些先流出的峰最明显，因为它们的体积最小（峰最窄）。图5-25a说明了该效应。其中从3μm细径柱中先流出的较窄峰有明显的拖尾，就是因为与本“标准” HPLC系统有关的柱外谱峰展宽的作用。而体积渐大的后期流出峰的拖尾现象却逐渐变弱。这种现象（先出峰拖尾最甚）是仪器存在柱外效应的最好佐证。在图5-25b中，由于使用了死体积小的“细内径” HPLC仪器，峰拖尾便不明显了，而且保留时间也变短了。特别要注意，图5-25b中细径柱峰的塔板数显著大于图5-25a中的标准柱的峰。 在试图建立分离之前，应消除由于柱外效应引起的峰展宽与拖尾，或使之减至最小： 1进样体积要小（一般≤25μL） 2在进样阀与色谱柱，色谱柱与检测器之间用细径柱的短连接管线（例如，20 cm，内径为0.07时） 3确保所有管线用匹配的接头正确连接 4使用易清洗、体积小的检测器流通池（<8μL） 各种化学作用也可以引起峰拖尾或峰不对称，包括流动相/固定相组合与样品之间的不 28 29 匹配。用含有醋酸盐另加三乙胺的流动相往往能消除这种不良影响（形成5-4-1节中的“通用柱”）。这时，只有更换完全不同流动相/固定相组合（例如由反相换为正相），才能解决峰拖尾的问题。 流动相A4.73min乙腈BAB吸收值4.41min8.66min0时间（min）图5-24 样品溶剂进样的影响 09.03min 样品体积：30μl；流动相：18%乙腈-水；以纯乙腈与18%乙腈-水流动相注入的咖啡因（A峰）与水杨酸胺（B峰）。 色谱柱中的金属污染（Al、Fe、Ni等）可使某些化合物的谱峰拖尾。污染金属可由填料本身带进，也可由侵蚀性流动相缓慢溶解柱进口的金属滤片，再沉淀到柱填料中。图5-26所示为由于C18填料被金属污染，造成碱性药物的拖尾情况。用高纯度的硅胶担体一般可消除可能的重金属络合问题。 5-4-3色谱柱寿命 用于正相分离的色谱柱常比其它HPLC方法的柱子更稳定。如用来分析“干净”样品，一些正相柱（如硅胶、氰丙基）的使用寿命高达一年以上。聚合型的离子交换（树脂）柱也具备类似的稳定性。而另一方面，以硅胶为基质，用于反相、离子对和离子交换色谱的柱，在这些分离所需的水环境中欠稳定。尽管如此，如果应用条件合适，制作良好的色谱柱在反相条件下，仍能连续稳定地使用数月（成百上千份样品）（见5-2-3节）。在下面几节中，我们简要讨论色谱柱中的主要问题与减少和纠正这些问题的技术。 色谱柱降解（或“失效”有几个原因： 1进口滤片或柱床部分堵塞 2吸附有样品杂质（“污物”） 3柱填充不良 4机械及热冲击造成空洞 5担体或固定相遭化学侵蚀 29 30 色谱柱将失效的一些“症状”； 1色谱柱的反压增高 2：谱峰拖尾 3：塔板数下降 4：选择性下降 5：保留值减小（或碱性化合物在硅胶基质柱上增大） 甲苯N=4970k’=0.4进样间-三联苯N=5640k’=0.7硝基苯N=11400k’=1.6标准柱外硬件（a）甲苯N=17200k’=0.1间-三联苯N=19200k’=0.5硝基苯N=21200k’=1.4进样小的柱外硬件（b） 图5-25柱外效应造成的谱峰拖尾 色谱柱：15×0.45 cm，3μm Spherisorb 硅胶；流动相：己烷-乙腈（99：1 V/V）；流速：2.0ml/min。（a）10μL进样阀与8μL检测器流通池的商品色谱仪；（b）0.5μL进样阀与1μL检测器流通池的低体积系统。 表5-13概括了色谱柱问题的常见原因以及辨认这些问题的实验参数。比如，滤片与柱床的堵塞，通常会增加色谱柱的反压（╳），一般会严重影响谱峰形状（拖尾）与柱塔板数（╳╳）。 表5-13排除色谱柱的问题 原因 堵塞 空洞 吸附样品 化学冲击 压力 ╳ ？ 拖尾 ╳╳ ╳╳ ╳ 塔板数 ╳╳ ╳╳ ╳ ╳ 选择性 ╳ ╳╳ 保留值 ╳╳ ╳╳ 5-4-3-1色谱柱滤板问题 专业人员遇到的最常见的色谱柱问题，都与柱进口滤片的堵塞有关。堵塞的滤片往往与保护柱（如果使用的话）的进口有关（见5-2-3节）。如上所讨论，造成异常峰形的原因，往往是部分堵塞滤片或色谱柱进口处的凹陷。如果怀疑是滤片堵塞，用已知的操作条件，运行一次标准品即可证实。当更换滤片时（不要试图清洗！），应检查柱进口是否有凹陷。如果填料不与色谱柱的顶端齐平，则说明填充床已凹陷了。如上所讨论，柱进口的凹陷问题，有时可再用填料填平进口处解决。如不能更换滤片，应以强溶剂反向冲洗色谱柱，看是否能将进口滤片的堵塞物冲洗出去。（注意：当试图冲洗滤片时，应先将色谱柱与检测器断开，以防可能堵塞检测池。） 注入含有颗粒的样品迟早会堵塞色谱柱进口，降低色谱柱的正常寿命。颗粒也会因进样器与泵密封垫的磨损而带入。在进样阀与色谱柱之间使用0.25或0.5μm的在线滤器，通常 30 31 可排除这类问题。这些小体积滤器设计得尽可能减小柱外效应，但经一系列进样后必须更换。色谱柱反压的不断增加通常说明进口滤器需要更换。在线滤器不能代替滤除样品中明显颗粒的步骤，需要注入样品前，先经滤过或离心。乳浊或浑浊样品应以0.25μm滤膜处理。用撞于注射器上的小滤头操作较方便。最后，由于密封与转子磨损造成的微粒是堵塞滤片的主要来源，更换泵密封垫与进样阀转子一般能减少滤片堵塞的问题。 BACD（a）EBCADE（b）0510时间（min）15 图5-26 金属污染C18硅胶造成的碱性药物拖尾 （a）初始的硅胶担体；（b）酸洗后的硅胶担体；流动相，20mM三甲胺。 5-4-3-2强保留的样品组分 强吸附性的样品组分聚集在柱进口的填料上，能严重地缩短色谱柱寿命。分析复杂样品时，像生物组织或体液（如血浆）的提取物，含油剂等这种滞留成分的聚集尤成问题；但相对较纯的样品，如合成药品，一般问题不大。色谱柱应用中，严重拖尾峰的出现（如图5-23）往往是强保留污染物在柱进口处聚集的信号。在进样阀与分析柱之间加接一支保护柱，能够减少这些“污物”的聚集。保护柱通常为一支填充良好的短柱（如1~2 cm），内装有与分析柱相当（或相似）的填料。它能捕获强保留的样品组分，防止进入分析柱。这种保护柱用过之后，可与分析柱分开，以强溶剂反向冲洗，除去其中的污物。或在强保留组分流入分析柱之前，必须定期更换保护柱。有些用户由于额外的费用与不易确定何时该更换新柱，不喜欢用保护柱，有些保护柱的质量问题也限制了它们的应用，尤其是小体积的高效柱，它们的性能特别易受柱外谱峰展宽效应的影响。 至少每日用强溶剂冲洗色谱柱（先卸下保护柱！）能延长色谱柱等度分离时的寿命。这种预防性保养方法能除去在柱进口处缓慢聚集的强保留成分（亦见5-3-2节）。（甲醇或乙腈 31 32 用于反相，甲醇用于正相。）在极端的情况下，可用强溶剂反向冲洗色谱柱。在梯度分离中，用强溶剂清洗色谱柱实施较方便，每次梯度结束时，以100%强（B）溶剂冲洗色谱柱至少20~30倍柱体积。“脏”样品应进行预处理，除去强保留组分（晚流出物）以及微粒。第4章中，我们讨论了样品预处理方法。另一方面，适宜地应用保护柱是有效的，日常应用中最好使用。 5-4-3-3填充不良的色谱柱 填充柱的初始状况与其使用的方式对其本身的寿命有重要的影响。较短时间应用后，填充床的压缩通常使柱进口处产生凹陷，柱塔板数突然降低。色谱柱填充不良时，会出现凹陷。遗憾的是，色谱柱的初始状况（即塔板数、不对称因子等）往往不能很好地说明柱床是否稳定。它只能在实际应用中受力时来确定。此问题的实用答案是使用一贯生产稳定产品厂家的色谱柱。 5-4-3-4压力影响 应避免突然的压力波动与任何的机械与热力冲击，这会有助于尽量减少峰形与N值的变化，而这些变化将决定是否更换色谱柱。各种机械与热力冲击（如色谱柱掉在实验台上或遽然改变柱温）也应尽量减少。进样过程中，转动进样阀太慢引起压力波动，会使色谱柱产生裂隙，这是某些自动进样器的专属问题。压力波动也是柱切换方法的一个专属问题（见4-6节）。阀切换时无压力波动的特殊阀已经问世（如Rheodyne MBB）。使用填充良好的色谱柱，在低柱压下操作，可大大减少由于压力波动造成的分离度损失。由于制作良好的色谱柱普适性能好，有关压力的注意事项对延长硅胶基质色谱柱的柱寿命不太重要。然而，其它类型微粒的色谱柱有时太脆弱，不能抵御显著的流速、压力和温度的变化。 5-4-3-5化学影响 在分离中，固定相的流失会显著地降低色谱柱的使用寿命。应避免使用能导致固定相迅速流失的固定相/流动相组合（采纳色谱柱生产厂家的建议。）短链硅烷基团的反相柱最不稳定，在强侵蚀性的流动相中（如p H<2.0），这类柱中有些在几小时之内可流失掉大多数的有机相。长链烷基反相柱（C8或C18）一般认为较稳定。然而，即使这些色谱柱在极低或极高p H应用时，键合相也会流失。用空间保护的硅烷固定相，能在侵蚀力强的低p H环境中显示较强的稳定性（图5-12）。实际上，假如遵守适宜的操作步骤（2.5≤p H≤8.0），许多C8和C18色谱柱往往具有长期的稳定性。 5-4-3-6其它因素 反相色谱柱上键合的有机配位体的稳定性取决于用作担体的硅胶的类型与酸度。用经完全羟基化的硅胶制得的填料，其表面的硅羟基分布均匀单一，具有上乘的稳定性。有研究表明，反相填料的稳定性与硅胶表面的p H密切相关。用表面酸性低、纯度高的硅胶担体制得的色谱柱，键合相稳定性显然较高（见表5-4）。 在高温时，硅胶基质色谱柱上的固定相流失加速。图5-27为致密键合的二甲基- C18柱，0当温度由40增加到60C，并用p H7的磷酸盐缓冲液时，硅胶担体溶解性的巨大差异。当用磷酸盐缓冲液，以中等或高p H操作时，应小心使用超过400C的温度。用有机缓冲液（如TRIS、HEPES、枸橼酸等）与在中等p H（6~9）使用磷酸盐缓冲液相比，可显著延长色谱柱的寿命；亦见图5-16。在p H4~6操作的色谱柱，高温时也较稳定，因为在该p H下常用的缓冲液（醋酸盐、枸橼酸盐）对硅胶的溶解度较低。在p H≤3时，高温操作能很快使键合固定相离解，导致长期保留值的重现性问题。有空间保护固定相的色谱柱例外（见5-2-3节）。二异丙基- C18填料的硅胶基质色谱柱在900C和p H0.9下能长期操作，未发现退化现象（见图5-12）。 在进样阀前加上一支填有硅胶的预柱（饱和柱），有时能增加在极端操作条件下使用的硅胶基质色谱柱的稳定性，尤其在p H>8.0。显然此预柱（可用稍粗的微粒装填）以溶解的硅胶饱和了流经的流动相，于是延缓了分析柱中硅胶的溶出。（应在此预柱后面再接一支0.2μm的滤器，以滤除进样器引入的微粒）。然而，用预柱也有以下缺点： 1使色谱柱总反压升高 2不能监测分析柱的压力 32 33 3减慢了色谱柱的换相与平衡 4不适用于梯度洗脱 结论是我们不推荐全面使用预柱，用更稳定的色谱柱或侵蚀性不强的流动相是较好的办法。 那些在室温配制并贮存一天以上的缓冲液和水溶液流动相常会产生微生物。由此产生的微粒会阻塞柱进口，显著地缩短柱寿命。因此，每天结束工作时应弃掉不含有机溶剂的水溶液流动相，或者在水性流动相中加200ppm的叠氮钠以抑制细菌生长。必须小心处理含叠氮钠的水流动相，因毒性并有潜在的爆炸性。在流动相中加20%的有机改性剂，也能抑制微生物的生长。有机改性剂还有助于流动相的脱气。 尽可能将色谱柱贮存于100%有机溶剂（乙腈最好）中，这是保存键合相柱性能与寿命的最好方法。应避免在缓冲液中保存（尤其那些含高浓度水和醇类的）。使用缓冲液时，应用15~20倍柱体积的不含缓冲剂的同种水-有机流动相冲洗色谱柱，然后再换成100%有机溶剂贮存。应避免用纯水冲洗键合致密的C18柱。贮存中，应将色谱柱两头塞紧，以防填充床干涸。 50040060度40度溶解硅胶的量mg30020010000246810洗脱剂体积（升）121416 图5-27用p H7.0的磷酸盐缓冲液时，温度对硅胶担体溶出的影响 色谱柱：Zorbax Rx- C18，15×0.46 cm；连续非循环的乙腈-0.25M磷酸钠缓冲液p H7.0，（20：80）；1.0ml/min。 表5-14概括了能确保良好柱寿命以及稳定性能的工作步骤。 表5-14保证良好柱寿命与性能的步骤 1用填充良好的色谱柱。 2尽量减小压力波动；避免机械及热冲击。 3用保护柱及在线滤器。 4经常以强溶剂冲洗色谱柱。 5预处理脏样品，以尽量减少无用的微粒与强保留成分。 6用稳定的固定相（C18最好）。 7当在中等pH操作时（6~8），用有机缓冲液。 33 8用< 400C的柱温（除非低pH时作空间保护）。 9大多数硅胶基质的色谱柱，应该保持流动相的pH在3.0~8.0。 10在水流动相与缓冲液中加200ppm的叠氮钠。 11过夜与储存时，冲洗掉盐和缓冲液，以纯有机相保存（乙腈最好）。 34 5-4-4方法建立的推荐色谱柱 大多数HPLC方法用硅胶基质的键合相柱作为分离介质。对于那些不需要其它类型的柱填料的分离情况，我们推荐下述色谱柱规格，作为大多数方法建立研究的新起点： 1色谱柱规格：25或15×0.46 cm ID 2担体微粒：5μm多孔硅胶微球 03孔径：80~100A（艾）（大分子除外） 4键合相：C8或 C18（用于反相）；CN或二醇基（正相），微粒表面积：150~350m2/g； 具备上述条件的色谱柱，性能好，来源广。随方法建立的进行，也可能需要其它规格、微粒的色谱柱。 34 本文来源：https://www.wddqw.com/doc/c2cb32bfde88d0d233d4b14e852458fb770b381a.html