组员：刘炎炎 吴颖川 邹琳 张雪娇 顾琦欣 一 实验目的 了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。学习细胞计数、营养液的配制等，初步掌握无菌操作方法。以及观察LPS和PHA对细胞生长的影响。 二 实验原理 (一)细胞原代培养 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 (二)细胞死活鉴定 死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。 染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括： 死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。甲基蓝有类似的染色机理。植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。 死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。美蓝是一种无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。 除此之外，还有一些细胞器的专有染料。如液泡系的专有染料中性红。中性红是一种低毒性染料，可以使活细胞液泡着红色，而细胞质和细胞核不被着色；死细胞的液泡不被着色或浅染，染料弥散于整个细胞中，细胞核和细胞质被染成红色。有时侯为了增加染色效果可以将两种染料结合使用，如甲基蓝-中性红混合染色法。 (三）化学试剂 LPS：脂多糖，脂质和多糖的复合物，为革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，大肠杆菌的脂多糖在实验室是常用的B细胞促分裂因子。但是高浓度的LPS会抑制淋巴细胞的增长。 PHA：植物血凝素，是一种有丝分裂原，能激活小淋巴细胞转化为淋巴母细胞，继而分裂增殖，释放淋巴因子。但是高浓度的PHA会抑制淋巴细胞的增长。 (四）MTT法 MTT全称为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。 三 实验器材 剪子，棉球，75%酒精，移液枪，无菌操作台，光学显微镜， 解剖盘，离心管，离心机，注射器，Eppendorf管，培养皿，酒精灯，塑料培养皿，载玻片，盖玻片，血细胞计数板等。 四 实验材料 小鼠1只，细胞培养液（含生长因子），Trypen Blue染液，PBS缓冲液，LPS， PHA， MTT， DMSO。 五 实验步骤 (一)细胞的原代培养 1.取材： 取小鼠一只，采用颈椎脱臼处死。清水洗小鼠浸入75%酒精中消毒5min，取出转入超净工作台内的解剖盘中，无菌操作打开腹腔，取出其脾脏，除去其周围的脂肪组织，并用PBS液自上而下淋洗1-2次。 2.分离脾细胞： 将取出的脾脏细胞置于含有滤器的培养皿内，向脾脏上滴加500微升PBS溶液，用注射器柄将其杵烂至至匀浆状态，加入500微升PBS溶液冲洗细胞筛，将获得的溶液中含有可见组织的重新转到筛上过滤。将获得的1mL 脾细胞匀浆转入10 mL 离心管中，加入三倍体积的红细胞裂解液，混匀，1000rpm / 5 min.离心弃红色上清。加入3 ml PBS 再洗2次。 3.培养脾细胞： 取塑料培养皿一套，用移液枪吸取培养液（RPMI-1640 （Invitrogen) +10% 胎牛血清FBS （GIBCO）+1%双抗P/S （GIBCO） 2mL加入塑料皿中，并将皿标记待用。取离心后的Eppendorf管，弃去上清液，用移液枪（200ul）吸取塑料皿中的培养液400ul加入弃去上清的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，吸取200ul脾细胞悬液接种于上述塑料皿中，混匀后放入37°C，5%CO2的培养箱中培养。（T,B细胞是悬浮生长的；108是接种塑料皿的浓度，106是接种96孔板的浓度） (二)细胞死活鉴定及计数 1.试剂配制：用生理盐水配成4%Tyrpen Blue染液，备用。使用时稀释至0.4%。 2.染色计数： 取0.5mL细胞悬浊液放入试管中，加入1-2滴染液。混合。2-5min后将细胞放在血细胞计数板上观察死活情况，注意不要有气泡产生，放大倍数为10x10。染色后活细胞不着色，死细胞显示蓝色。注意染色时间不能超过15min，否则染液将细胞毒杀。 3.计数： 在10x10倍的显微镜下观察，计算血细胞计数板的4个4小方格的细胞数量。包括细胞总数与死细胞数量。压线者计上不计下，计左不计右。 （三） MTT 法分析细胞增殖 将1 × 106 / mL 脾脏细胞悬液，接种于96 孔细胞培养板上，每孔加入200 μL 细胞悬液，按照实验设计分组，每个样品3 个重复孔，在37℃、5% CO2的培养箱里培养24、48、72 h 本文来源：https://www.wddqw.com/doc/77683d9c0740be1e640e9a02.html