一、大分子拥挤现象 在过去的几十年中, 对于蛋白质体外折叠的大量研究, 为理解细胞内新生肽链如何折叠成熟为具有一定功能的蛋白质以及克服大多数重组蛋白在重新折叠的过程中形成包涵体提供了充足的依据。现如今, 蛋白质的体外折叠已经广泛的作为一种研究手段, 从而理解与探究蛋白质在细胞内的折叠过程。 然而, 长期以来, 主要由于某些实际原因, 研究蛋白质体外折叠的实验一般是在一些简单的缓冲体系——稀溶液中进行的。在蛋白质的体外折叠实验中, 蛋白质通常保持低浓度, 以避免在再折叠反应过程中发生蛋白质自身聚集现象。这种人为的理想状态和细胞内实际所遇到的状态存在着一个最大的不同点: 细胞内含有大量的可溶或者不可溶的各种大分子物质, 它们以不同的浓度而存在, 甚至某些大分子物质的浓度会达到很高的水平。因此, 这些不同种类的大分子物质占据了细胞总体积相当大的一部分, 使得细胞内变的拥挤不堪。在生命有机体中, 目的反应并不是在无任何约束的稀溶液中进行。在大多数的生理液体媒介里, 5%～50% 的质量是大分子, 远比通常体外研究所用到的溶液要拥挤的多。大多数的生命化学反应, 相对于实验室条件下的生化反应, 是在极其拥挤的环境体系中完成的。这些大分子的存在显著改变了细胞中溶质分子的活性系数。随着对这种现象的逐渐了解与认知, 研究者们基于此现象提出了一个全新的概念—“大分子拥挤”[1]。“大分子拥挤”这个概念形象的描述了生命系统这一客观存在的现象: 不论任何细胞, 其内部都是一种高度拥挤的状态, 生物大分子聚集在一起使得细胞内的总浓度达到了一种相当高的水平, 致使细胞总体积有很大一部分被这些大分子占据, 因而这些被占据的体积则不能被其他分子利用。多糖, 蛋白质, 核酸以及各种各样的细胞器使得细胞内变的非常拥挤。例如, 细胞内蛋白质的总浓度达到200～300g/L , RNA 的浓度达到75～150g/L , 则大肠杆菌中蛋白质和RNA 的总浓度达到300～400g/L 。而血红细胞里血红蛋白的含量达到350g/L [2 ]。有关大分子拥挤的最新的观点是在11 年前由GB Ralston 提出的[3 ] , 他总结说:“尽管大分子非理想性的现象已经被人们认知多年, 且大分子拥挤的生物相关性也得到了明确的描述, 但在生物化学课本中这一领域却是一片空白。”观之目前的生命科学领域, 这种忽视仍在继续。生物大分子是在细胞内拥挤环境的状况下演变, 发挥功能的, 因此, 大分子拥挤现象是值得注意的, 不应再被忽视。 二、已占体积效应 粗略的估计, 细胞内大约有20%～ 30% 的体积是被大分子占据的。从此种程度上来看, 大分子拥挤可以更为确切的定性为“已占体积效应”[4 ]。概括而言, 这是一种由于空间排斥而引起的纯物理性质的非特异性效应。这种非特异性的空间排斥是自始至终存在的, 即拥挤效应就如同重力一样, 它是不可避免的。1981 年A. P. M inton 首先提出了“已占体积效应”理论[5 ]。根据这个理论, 研究者们建立了一种类模型用以阐明“已占体积效应”。在这个类模型中, 用一种悬浮液表示细胞内拥挤的大分子溶液，一种或几种致密的粒子悬浮其中以代表相对应的细中的大分子, 它们具有较为接近的体积和形状。 The crowded state of the cytoplasm in (a) eukaryotic and (b) E. coli cells 三、大分子拥挤与蛋白质折叠 近期以来, 体外模拟大分子拥挤对蛋白质折叠反应的平衡及反应动力学的研究较多。Zimmerman 和M inton建立了不同的反应模型系统[6 ] , 通过系统反应测试大分子拥挤环境对反应速率和反应平衡的影响。结果表明, 加入大分子拥挤试剂后, 不仅加快了反应速率, 而且使得平衡向着结合的方向移动。已占体积理论认为, 高浓度的惰性大分子可以巩固稳定致密的蛋白质的天然状态。A. P.M inton 建立了一个更为详细的模型以解释这种效应——提高惰性大分子的浓度, 可以降低解折叠多肽链的含量并最终导致平衡向着形成蛋白质天然结构的方向移动[7 ]。 当溶液中的蛋白质浓度增加, 拥挤效应对活性系数的影响远比对浓度的影响要大的多。A. P. M inton 于1983年就发现, 将血红蛋白的浓度从20g/L 升高到30g/L 时，其活性系数增加了10 倍[8 ]。同时, 拥挤效应对活性系数的影响还和参与的蛋白质的构型熵有关, 拥挤环境限制了蛋白质相互反应过程中的构象变化[9 ]。 已占体积效应可以很好的解释在拥挤环境条件下的蛋白质折叠过程中的同源聚合反应和异源聚合反应。Ralston 和Co le 通过实验发现, 给反应体系中加入聚蔗糖Dextran 或聚乙二醇PEG, 可促进血影蛋白从其二聚体形式向四聚体形式转变[10 ]。L inder 和Ralston 也发现血影蛋白二聚体与四聚体之间的平衡受到了拥挤的影响, 拥挤增加了缔合速率常数[11 ]。1999 年, R ivas 等人发现, 在高浓度的牛血清白蛋白BSA 溶液中(> 40g/L ) , 血纤维蛋白原单体(其与BSA 之间不会发生异源聚合) 倾向于形成二聚体甚至形成更大的寡聚蛋白[12 ]。 然而, 拥挤也会引起部分折叠蛋白质之间的相互聚合从而降低了部分折叠蛋白质转变成为天然功能蛋白质的数量。较为详尽的关于大分子拥挤对蛋白质折叠的影响的报道要数V an den Berg 等人的发现了。他们认为, 拥挤体系加强了非天然蛋白质之间的聚合程度。在大分子拥挤环境中, 和已占体积效应对非天然蛋白质命运的决定影响力相比, 蛋白质与拥挤试剂之间的异源聚合反应在蛋白质的再折叠过程中发挥了重要作用[13 ]。实验采用的复性缓冲体系含有300 g/L 的拥挤大分子, 拥挤大分子分别采用聚蔗糖Dextran 70, 葡聚糖Ficoll 70, 牛血清白蛋白BSA。以还原型溶菌酶作为测试对象, 分别测定其在不同拥挤试剂条件下的复性产率, 得到的结果表明复性产率显著好降低。通过实验发现, 分别以多糖和蛋白质作为拥挤试剂, 结果有很大的区别: 蛋白质BSA 的影响要比多糖Dextran 70 及Fico ll 70 的影响严重的多。尽管BSA、Ficoll70、Dextran70 有着近似的分子量, 但是, 它们在缓冲体系中所引起的对还原型溶菌酶的排阻体积效应很可能不同。BSA 为球型的蛋白质, 而Ficoll 70 或Dext ran 70为无交联结构或部分交联结构。其次,BSA 具有17 对二硫键, 那么在完全还原的溶菌酶的再折叠过程中,BSA 可能会和还原型溶菌酶上的巯基形成错配的分子间二硫键。BSA 和溶菌酶形成的中间体的结构仍然还是未知, 但是溶菌酶是一个碱性蛋白质, 很容易和酸性的蛋白质如BSA 发生反应[13 ]。 四、展望大分子拥挤 大分子拥挤是普遍存在的, 各种类型的细胞中都有发生。所以有机体进化了机理以保证新合成的多肽链在高度拥挤的环境中能够正确折叠。一方面, 分子伴侣和折叠酶可以帮助多肽链在高度拥挤的环境中正确折叠; 另一方面, 多肽链本身具有折叠信息以应对大分子拥挤。不同的蛋白多肽链获得不同的应对高度拥挤环境的能力。可以设想, 正如控制pH 和离子强度等模拟细胞内环境的因素一样, 加入拥挤物质也会逐渐成为一种研究大分子的途径, 从而加深对分子间相互作用的了解。 本文来源：https://www.wddqw.com/doc/cd49b9c0d5bbfd0a79567397.html