文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑.欢迎下载支持. 对三组老鼠分开并进行对照试验：第一组老鼠用常规水量保持培养（n = 16 WT; n = 10 Tg），第二组老鼠注射AOM和实验剩余水量(n = 9 WT; n = 7 Tg)，第三组老鼠用DSS进行培养而且控制不注射AOM(n = 20 WT; n = 8 Tg)。AOM 单独注射烷化剂为了说明没有炎症，而且结果说明没有使用剂量（25）导致无肿瘤形成。DSS单独重复周期注射，以观察是否有发育不良，发炎等症状。这样一个研究的目的是为了最终说明在控制变量、除死亡老鼠的干扰的前提下。体重变化，大便的一致性，以及血压变化等情况来判断DSS是否有治疗康复作用。切除死亡老鼠的结肠至肛门部分，并对剩余部分进行解剖，最终进行组织学分析。 评估死亡率，按照相同步骤将时长延长至126天直到老鼠直肠脱垂或者超过20%的体重损失的情况除外。最后再用显微镜进行宏观息肉分析。 临床评估 体重减轻，大便的一致性进行评估，并同时测试统计其他变量和总有血(Hemoccult SENSA; Beckman Coulter)以确定每天在DSS管理产生的临床活动以先前所描述的评分（12）一致。在恢复期间，每周对实验组进行一次体重重测。 内镜下息肉的形成和息肉数评估 结肠镜检查是为了利用coloview评估老鼠（卡尔Storz内视镜息肉形成的途径）。老鼠1.5%至2%异氟醚处死和大约3厘米的结肠近端到肛门可视化与空气的结肠充气后。老鼠颈椎脱位后，异氟醚的安乐死。结肠切除盲部至肛门，0.9%的NaCl洗净，剖开，并保存在10%中性缓冲福尔马林。使用jenko解剖显微镜测定息肉的数目和大老。 组织病理学评分 10%的重性甲醛固定好结肠，用石蜡包住，横切片5 μm，并用苏木精和曙红染色息肉和腺癌的组织病理学检查染色（瘤）。由两位合格的病理学家共同进行评估。得分是根据这些标准：正常（0分），低度异型增生（1分），重度异型增生（2分），粘膜内腺癌（3分），和浸润性癌（4分）。 免疫组化 石蜡包埋的切片(5 μm)结肠用Ki67染色作为细胞增殖标记，如前（12）。每节用最老15腺且形态正常的Ki67阳性细胞进行每节计数。 末端脱氧核苷酸转移酶介导dUTP缺口末端标记染色 从石蜡包埋切片疫荧光原位末端标记（TUNEL）染色进行了测量，采用细胞凋亡原位细胞凋亡检测试剂盒制造商的描述（Roche）。4′细胞核染色，每窝计数细胞总数6-diamidino-2-phenylindole。最老的形态正常隐窝计数每节10。 文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑.欢迎下载支持. p53基因突变分析 从石蜡包埋切片（7μ米）的老鼠结肠显微切割肿瘤组织。从显微组织基因组DNA，用DNA提取石蜡包埋组织纯化试剂盒（Qiagen）分离。PCR产生的扩增产物序列为先前描述的（26）。引物序列见补充材料和方法部分。 人的组织样本 正常匹配进行组织的肿瘤的手术切除与一个或多个UC相关的结直肠肿瘤患者的时间，包括腺癌或发育不良。正常对照样本为正常结肠黏膜邻近肿瘤或回肠粘膜。无明显不良的患者获得了加州大学组织的认可。所有组织大体进行周围正常组织的解剖，和平行特征的切片用于组织病理学。患者根据机构审查委员会的指导方针组织收集。 总RNA的提取和定量实时PCR 使用人体组织提取总RNA试剂盒（Qiagen公司）。实时定量PCR进行了先前所描述的（11）。引物序列见补充材料和方法部分。 细胞培养和转染 Caco2 BBE细胞被用来评估PHB与STAT3的相互作用。作为Caco2 BBE细胞突变型p53，WT HCT116人类大肠癌细胞被用来评估PHB与p53的相互作用。从美国典型培养物保藏中获得的所有细胞系。细胞培养和转染如前所述，（kathiria和同事；提交出版）。 γ照射 γ照射诱导WT和p53−/−HCT116细胞转染后72老时DNA损伤（27）与载体的PHB。细胞利用137Csγ-在6.5 cGy的/ S为32秒，共209.4 cGy照射器照射。收获细胞，24老时照射后γ-为随后的分析。 提取蛋白，Western印迹分析和免疫共沉淀 从TG和WT老鼠（12）分析先前所描述的粘膜剥离层得到Western blot。总蛋白从细胞先前所描述的分离（kathiria和同事；提交出版）。使用老鼠单克隆抗体的PHB（Thermo Fisher），p53，bcl-2的老鼠单克隆GFP，bcl XL，坏和兔多克隆Bax，银杏内酯B（丝氨酸155），STAT3（圣克鲁斯生物技术），兔多克隆增殖细胞核抗原（PCNA）抗体（图），兔多克隆caspase-3，p53，PSTAT3（细胞信号转导技术），兔多克隆的p53上调凋亡（彪马），与老鼠单克隆抗β肌动蛋白（西格玛奥德里奇）。 PHB进行免疫沉淀从0.6毫克总蛋白裂解HCT116和Caco2 BBE细胞或0.20毫克总蛋白裂解老鼠粘膜1μG鼠抗PHB，抗p53抗体，或anti-pstat3 30μL 50%蛋白A琼脂糖珠（GE医疗）。最终与兔p53抗体或抗体孵育法，分别在免疫原的抗体作为进行作为阴性对照。 统计分析 值表示为平均±SEM。统计分析使用2-way ANOVA分析，随后的两两比较采用Bonferroni事后进行。P值老于0.05被认为是具有统计学的分析意义。 结果 本文来源：https://www.wddqw.com/doc/d0b80497842458fb770bf78a6529647d26283417.html