NIS-emelments软件操作指南
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NIS-Elements AR 快速上手指南 尼康仪器（上海）有限公司 2009年4月 NIS-Elements软件操作指南 （一） 认识NIS-Elements的操作界面 （1）主菜单栏；（2）上图标工具栏；（3）左图标工具栏；（4）窗口排布选择；（5）控制窗口边栏； （6）图片显示区域；（7）状态栏 上图标工具栏和左图标工具栏图标介绍： Open：打开文件 Save：保存当前文件 Save next：将当前文件保存为新文件 Print：打印 Undo：撤销前一步操作 Redo：还原一步撤销的操作 Live Fast：快速预览 Z Stack Live：Z轴序列预览 Integrate：叠加，多次拍摄图像累积 Average：平均，多次拍摄图像平均 RAM Buffer ON：打开内存拍摄 Capture to RAM Buffer：拍摄存至缓存 Capture Multichannel：拍摄多通道 Capture Multipoint：拍摄多点 Copy：复制 Paste As New Image：粘贴复制图像 Crop：剪切 Run Macro：执行宏命令 Close All：关闭全部窗口 General Option：打开设置窗口 Customize Toolbar：自定义工具栏 · Backgroud Correction ON：打开背景校正 Optical Configurations：打开光路配置设定 New Optical Configuration：创建光路配置 Pointing Tool：指针按钮 Magnifier Glass：图像放大工具 Annotations & Measurement：注释和测量 Binary Toolbar：二元蒙板编辑工具 Define/Run Experiment：打开多维拍摄窗口 Capture Time Lapse：拍摄时间序列 Capture Z Series：拍摄Z轴序列 控制窗口介绍： NIS-Elements软件所有控制窗口均可以在主菜单栏View菜单下找到，或者在图片显示区域点击鼠标右键弹出。 Acquisition： AVI Acquisition：AVI拍摄 Auto Capture Folder：自动拍摄存储文件夹 Camera Settings*：相机设定 Capture FRET Image*：拍摄FRET图像 Filters and Shutters*：滤色块和光闸控制 Lamp*：光源控制 ND Acquisition*：多维图片拍摄 Nosepiece*：物镜转盘控制 Microscope Control Pad*：显微镜控制面板 XYZ Navigation*：XYZ导航 Z Series*：Z轴序列 Visualization: Binary Layers：二元蒙板层编辑 Histogram：柱状图 LUTs: LUTs Opened Images：已打开图像 Analysis: Annotations and Measurements：注释和测量 Automated Measurement：自动测量 Automated Measurement Results：自动测量结果 Binary Toolbar：二元蒙板编辑工具 Colocalization：共定位分析 EDF Z-Profile*：Z序列景深扩展 Intensity Profile：光强分析 Object Count*：目标计数 Object Classifier*：目标分类 Pixel Classifier：像素分类 ROI Statistics：ROI统计 RT Deconvolution*：实时反卷积 Thresholding： 阈值分析 Time Measurement：时间测量 Tacking*：轨迹分析 Volume Measurement：体积测量 Preview： 预览窗口 Synchronizer：窗口同步器 XY Overview*：XY预览 * 对应的窗口是可选的，在选择了相应软件模块，插件或者相关电动部件正确连接下可使用。 （二）NIS-Elements软件的开启和图片拍摄 Ⅰ. 打开NIS-Elements软件： 1. 在开启软件前，请确认已打开所有需要用到的硬件。双击桌面图标打开软件（Vista系统需要点击Allow确认运行该软件）； 2. 选择对应的相机，点击继续。如果只是做图像分析，请选择No Grabber。单击OK； 注意：相机的选择在NIS-Elements打开后也可以进行，选择Acquire菜单下Select Camera选项，确认要选择的相机并激活使用。多相机切换也可以通过此选项完成。 3. 右键打开Camera Setting，在设置界面设置相机曝光时间，分辨率以及其他可调的设置； Ⅱ. 单张图片拍摄： 1. 配置光路， 显微镜拍摄图像时，必须根据需要成像的模式设置好光路（参考显微镜操作指南），出光口切换到相机所安装的端口（例如L100，R100等）。 2. 从相机预览图像，点击上工具栏 图标，进行图像快速预览，该预览模式图像属性对应camera setting窗口的fast Capture设定。点击 图标，进行图像预览，该预览模式图像属性对应camera setting窗口的Capture设定。单击 图标，预览停止。 3. 图像拍摄，设定曝光时间或点击自动曝光后，点击 按钮拍摄一张图片。 注意：彩色相机需要在拍照前将探测框放在空白位置做白平衡，以避免拍摄画面色彩失真。 Ⅲ. 时间序列图像拍摄（Time Lapse Acquisition）： 1. 点击Acquire菜单下，Capture Time Lapse选项，打开如上窗口，在Time Schedule里（图片2位置）设定需要拍摄时间序列图像的时间间隔，总图片数，或者总时间（总图片数和总时间只需要根据实验需求设定其中一个，软件自动计算另一个数值）；也可以定义多个不同的时间序列，软件将依次执行。 2. 选择图片1位置Save to File选项，图像序列可以一边拍摄一边保存，以避免断电或内存不足等意外造成前面拍摄数据的丢失。拍摄数据量很大的情况下，请选择此项并设定保存文件夹。 3. 图片3位置对应可以在拍摄时进行的操作，例如关闭透射光等待1秒，自动对焦的设定等，还可以在运行拍摄程序前后加入相应宏命令来达到想要的功能。例如在拍摄前执行Live（）；命令，可以应用自动曝光来拍摄每一帧，使拍摄图片达到最佳曝光时间。 4. 选择Perform Time Measurement选项，选定ROI区域，可以在时间拍摄过程中实时监视荧光强度的变化。拍摄进度可以在本窗口最上面进度条上显示。 5. 点击Run Now按钮开始拍摄。 注意：配置电动光闸或电动长寿命汞灯情况下，做长时间拍摄，请选择Close active Shutter when Idle选项，以避免荧光淬灭，长时间强光照射造成细胞的光毒性。 注意：Live（）；宏命令在大部分情况下可以正常使用，但是在某些循环设定的情况下可能工作不正确，当遇到此情况时，请使用LiveNoMsgLoop();宏命令代替。 Ⅳ. 多点图像的拍摄（Multipoint Acquisition） 1. 在配置了XY电动载物台并正确连接时该功能可以使用，点击Acquire菜单下，Capture Multipoint选项，打开如上窗口，在Points栏里（图片1处）设定需要拍摄多点图像的各个位置，可以根据需要点击列表前空白的可选框，增加当前预览位置为拍摄的一个位置； 2. 如果需要回览前面选定的点，只用鼠标左键单击相应的列表项目，载物台将自动移动到对应的位置。如果需要微调并更新这个位置，请单击XYZ数值旁边的箭头按钮（如1处列表#3的显示）更新位置列表； 3. 列表里的所有点的相关信息可以在图片3处的选项里被保存和重新调用； 4. 点击Run Now按钮开始拍摄。 注意：如果对例如使用96孔板等规则排列的位置进行拍照，可以使用WP下拉菜单下Custom选项，定义行数和列数，以及起始和终止位置，一次获得多点的定义。 注意：当配置PFS时或者选择自动对焦拍摄，Z轴位置可以不包含在多点设置内（图片2位置选择），可以去掉此项选择。如果是单个样本的同一层面的多点观察可以选择PFS一直开着。 Ⅴ. Z轴序列拍摄（Z Series Acquisition） 1. 点击Acquire菜单下Capture Z Series里Capture Automatically选项，打开如上窗口，在范围设定里（图片1位置）选定需要拍摄Z轴图像的范围，有从左到右对应3个图标对应的3种不同的设定方式：选取顶面和底面、对称范围选择、不对称范围选择，后两种方式只需要找到焦平面根据经验设定上下偏移的范围即可。 2. 当拍摄区域选择完毕后，在图示2的位置，会出现扫描范围显示，设定需要拍摄的步进距离或者拍摄Z轴层数，选择仪器所配置的电动z轴设备； 3. 点击Run Now按钮开始拍摄。 注意：PFS功能在Z轴拍摄时会自动关闭，拍摄完毕后重新开启，并回到之前定义焦平面。 Ⅵ. 多色荧光<多通道>拍摄（Fluorescence Acquisition ） 1. 点击Acquire菜单下，Capture Multi-channel Image里Capture Automatically/manually选项，打开如上窗口； 2. 通道设定，如图1位置，在Optical Conf.下拉菜单里选择需要拍摄通道的光路配置，如果没有对应的选择，可以新建一个新的optical configuration，并选择最后得到画面的伪彩色。可以根据需要设置各个荧光通道和DIC通道； 3. 点击Run Now按钮开始拍摄，如果配置了手动的设备，需要选择图片2位置的选项，在拍摄前手动切换光路。 注意：卤素灯开启到光亮度稳定大约需要2秒，在拍摄DIC图像时，如果直接拍摄会导致曝光不一至问题。解决此问题可以配置透射光光闸或者在拍摄DIC图像之前利用宏命令等待2秒。同样，关闭卤素灯也需要约2秒时间，请将荧光通道拍摄放在DIC通道之前，或者等待2秒拍摄。 Ⅶ. 拼图功能（Large Image Acquisition） 1. 在电动载物台配置并正确连接时，点击Acquire菜单下，Grab Large Image里Capture Automatically选项，打开如上窗口，选择设定需要拍摄的视场数目或者面积大小； 2. 点击run now按钮开始拍摄。 注意：在未配置电动载物台时可以在Acquire菜单下，Grab Large Image Manually选择手动拼接图片。 Ⅷ. 6D拍摄（6D Acquisition） 1. 在已购买6D插件时，点击Applications菜单下，Define/Run Experiments选项，打开如上窗口，选择需要进行多维拍摄的项并参照前面所述设置各个拍摄条件； 2. 拍摄顺序在进度栏里从上到下排列，可以选择右边箭头来更改拍摄顺序（请注意不是所有顺序都可以更改）。 3. 点击run now按钮开始拍摄。 （三） 图片的保存和查看 Ⅰ. NIS-Elements软件图片图层： NIS-Elements软件显示图片分为3个基本层次： 1). 注释层：保存注释，测量信息； 2). Binary层：二元阈值分析； 3). 图像层：根据相机不同获得不同位深的图片。 Ⅱ. NIS-Elements文档类型 1). RGB图像：彩色相机拍摄图片格式； 2). 多通道图像（Multi-channel）：多通道拍摄单幅图片； 3). Nd2多维图像：包括时间，Z轴，多点，多通道等的多维图像。 Ⅲ. NIS-Elements拍摄图片保存的格式： NIS-Elements软件默认的图片格式有2种，jp2000格式用于单一图像的保存，nd2格式用于多维图像的保存。图像也可以保存成tif，jpg，bmp，gif，png等，多维图像可以保存成avi等常见格式。 注意：请在保存所需要图片格式前保存拍摄默认原始格式，原始格式包含图片拍摄所有条件信息。查看拍摄信息，请在图像上单击鼠标右键选择image property。调用原图片拍摄条件，请在图像上右击鼠标选择reuse camera settings工具。 注意：如果要在Windows或者Office软件里查看拍摄得到的图片，需要在image菜单下convert栏里将图片转换成8位RGB图像，并另存为常见图片格式，例如tif，jpg等。如果需要批量转换图片，请参考本章后附件一。 Ⅳ. 图像查看 1). LUTs a. 执行LUT图标，应用LUT到当前图片； b. 实时LUT，根据当前画面自动调节LUT动态范围； 右上图中LUT 3个三角形依次为，背景扣除调节、对比度调节、荧光亮度增强调节。对于多通道图像可以分通道单独调节。 注意：应用f按钮后，图片原始荧光强度信息会被改变，如果要对图片荧光强度进行测量，请勿按此按钮。 2). 多通道平铺显示(Split Components) 3). 缩放控制（Room Control） a. 依次为适应窗口，原尺寸显示，放a. 多通道平铺显示按钮。 c. 自动调节LUT范围； d. 关闭LUT功能； e. 添加过饱和指示； f. 应用LUT到当前图像。 大，缩小按钮。 4). 一般控制（general control） a. 显示探测框，探测框应用与光强柱状图，自动曝光和自动白平衡功能； b. 显示背景框，背景框用于参考区域的背景扣减（Image >Background >Subtract Background）； 功能； e. 测量框，选择测量范围； f. 感兴趣区域选择； g. 路径光强分析，使用View>Analysis Control>Intensity Profile功能可以用来c. 显示网格，用来做粗略的距离的查看； d. 显示标尺，给图像加标尺，如果要用其他格式输出图片，请使用Burn Scale查看任意直线，折线路径上的各通道光强分布。 5). 状态栏（Status Bar）：显示当前图像定标信息，指针位置，光强，图像形式和分辨率。 6). 通道的控制: 对于多通道图片，用鼠标左键选择已拍摄图片的某个通道，将其拖出窗口即可得到单通道图像。如果要合并2个单通道图片，只需要将一张图片的通道选中，同样用鼠标左键将其拖动到需要合并的图片窗口即可。通道的颜色可以用鼠标在对应通道位置右击，在channel property对话框中进行更改。 7). nd控制 a). 在时间序列拍摄时插入一个事件记录点； b). 选择时间附近帧数播放，在此处点击右键设置； c). 帧域选择工具，按住Ctrl用鼠标左键选中单帧，按住Shift用鼠标左键可以选中一系列帧。在帧选择条中右击鼠标可以对选中的帧进行删除，保留等操作。 以上各个按钮处，均可以单击鼠标右键进行详细的设定和相应属性的更改。 d). 取消帧域选择。 e). 下面是播放控制栏，R表示实时播放，M表示最大速度播放。 8). nd图像查看（请看示例图片） a). 主视图，显示XY图像； b). 最大/最小光强重建； c). Z，T序列可用，同时显示正交位置的XY，XZ和YZ重建图像； d). Z序列可用，3维视图重建； e). Z，T和多点序列可用，平铺显示各拍摄图片。 （四）图片分析 1). ROI Statistics感兴趣区域统计: 在图片显示区域点击鼠标右键弹出菜单选择Analysis里ROI Statistics项，弹出以下窗口，ROI栏即可得到感兴趣区域面积，光强，信噪比等信息。 2). Thresholding阈值分析: 阈值分析是通过软件生成一个Binary图层，来进行图像的分析。 1. 阈值分析模式选择：根据所需分析图片类型选择相应的分析模式，RGB，HSI（对比度，饱和度，亮度分析），MCH（单通道分析），Intensity（亮度分析）。 2. 阈值选取工具，选取相应大小范围阈值加入到所选范围内，点击 可以对选取阈值范围更新计算Binary。选中 可以实时更新Binary图层信息。 3. 手动选择阈值范围，或者在左上或者右上角输入数字来约束阈值范围； 4. 从左至右依次为清除碎片工具，平滑边缘工具，形态学分割器，可以用来去除图片内细小碎片干扰，自动圆滑区域边缘，自动分割有交叠的多个目标； 5. 对上面得到的目标进行筛选工具，根据大小，周长，亮度等信息设定需要的Binary目标。 3). Binary Edit二元蒙板层编辑：NIS-Elements软件提供Binary编辑工具。按键盘的Tab键或者在Binary菜单选择Binary Edit项，软件自动切换到编辑界面，可以进行Binary区域的填充，切割，增加目标区域，修改目标区域等功能。 注意：Binary Edit可以进行前景和背景的编辑，编辑的时候请确认左上角图标是FG（前景）还是BG（背景）。 4). Object Count目标计数：依照Thresholding的方法选择相应的目标，按执行按钮，软件会自动计算当前条件下的目标数量，并在下面列表中显示每个目标的面积，平均光强，周长等等特征测量的信息（具体可测量的参数类型请参见软件手册）。选择 按钮可以以同样条件对整个nd文件的每一帧图片进行分析计数，然后在图标 右端下拉菜单选择输出格式为txt文本或者excel表格（需要系统安装了office）。如果要看所有目标的统计数据，请在ROI Statistics里的Binary栏查看。 5). Annotations and Measurements标注和手动测量： 此工具可以在图片上进行箭头，选框，文字，感兴趣区域的标记；测量长度，面积，角度，半径，半轴长等参数，显示在下面的数据表中。另外还有目标计数和分类等功能 6). Time Measurement时间测量：在时间序列图像上选取感兴趣区域进行时间测量，可以选择多个感兴趣区域进行测量，也可以对感兴趣区域的多个通道进行时间测量。测量结果可以以图表或者数据表格的形式输出（在Export选项进行选择）。 附件一：图像格式批量转换操作 如何用NIS-Elements进行图像批量转换，例如：用户拍摄得到的多个12bit多通道图像，希望快速对所有的图像格式进行转换，以便从windows里打开或者用其他图像软件编辑。 可以采用下列步骤： 1） 将所有需要转换格式的文件拷贝到一个新文件夹中（此项请特别注意，否则转换完成后原始图像会改变）； 2） 将以下宏命令粘贴在剪贴板中，并保存成8bitRGBsave.mac（请注意保存格式一致） ChangeColorDepth(8,1); ConvertToRGB(); ImageSave(); 3） 选择File / Sequences / Play Sequences命令，弹出如下窗口： 4） 在窗口左侧选择需要转换图片所在的文件夹； 5） 在Play Mode橙色框中选择：Open images to full screen或者Don’t load images, use commands； 6） 点击Execute Command(s)选项右侧绿色框中的 图标，弹出Paste Commands窗口（下图）； 7） 选中左边栏里Macro选项里面的RunMacro(…)选项，然后在红色框处指定图片格式转换8bitRGBsave.mac宏命令文件所在的位置，单击ok； 8） 点击Play，指令执行完毕按enter键退出。 9） 选择File / Sequences / Convert files命令，弹出如下窗口，选择前面转换相同的文件夹，在蓝色框位置指定需要保存文件夹，在output file format栏下选择tiff格式或者jpeg格式，点击ok完成。 10） 查看指定保存文件夹，即可得到需要的图片。 注意：8bitRGBsave宏文件包括了三个操作：图片转换成8bit，转换成RGB格式，保存。操作的前面部分是图像的转换，最后两步是文件格式的转换。软件版本不同，界面稍有不同，请根据实际情况操作。 本文来源：https://www.wddqw.com/doc/3a53742abdd5b9f3f90f76c66137ee06eff94e22.html