实验二 ? 琼脂糖凝胶电泳的制备及核酸检测 一. 实验目的 1 、掌握琼脂糖凝胶电泳的原理 ; 2 、学习琼脂糖凝胶电泳的操作。 二、实验原理 溴化乙锭（EB为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。 EB可与DNA分子形成EB-DNA 复合物，其发射的荧光强度较游离状态 EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA 的含量成正比。用肉眼观察，可检测到 5 ng 以上的 DNA。 1 •影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素： 1）DNA分子大小？ 迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子大小相等，电荷基本相等（DNA吉构 重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋 ＞线性 DNA） 2） 琼脂糖浓度：不同的凝胶浓度，分辨不同范围的 DNA Agarose： 0.5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb 1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb. 3） DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状 ＞线状DNA单链开环 4） 所加电压：低电压时，线状 DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝 胶上所加电压不应超过 5V/cm 5） 碱基组成与温度：一般影响不大 4 -30 C 6） 嵌入染料的存在：降低线性 DNA迁移率，（不提倡加在电泳液中） 7） 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响 DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动， 离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致 DNA变性，一般采用1X TAE 1X TBE 1X TPE（均 含 EDTA pH8.0）。 2•溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。 3．电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯晴呈蓝色，它携 带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。 4、电泳缓冲液： TAE TBE TAE与TBE不同之处在于TBE用硼酸代替了 TAE中的冰醋酸。 三、 仪器和试剂 仪器 微量移液器，电泳仪，电泳槽，微波炉 试剂 琼脂糖： 1.0%； 电泳缓冲液（50 X TAE电泳缓冲液取Tris24.2g ，冰醋酸5.7ml ，0.25mol/L EDTA （pH8.0）20ml ，加蒸馏水至 100ml ） EB： 5 卩 l / 100 ml TBE 电泳材料：标准分子量核酸（ DL2000） 四、 操作步骤 （1）制胶（以20 mL为例） a. 称取0.2 g琼脂糖，加入20 ml的TAE缓冲液（pH 8.0 ），摇匀； b. 微波炉加热，至琼脂糖完全溶解（要防止过热溢出三角瓶）； c. 将制胶板放入制胶槽中，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖(约 50C)加入2ul EB 后，混均匀，倒入其中，直至厚度为 4〜6 mm(如有气泡要把气泡赶出)，在室温下冷却凝 固( 约 30~ 45 min) ； d. 将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。 ( 2)点样 用微量移液器将5卩1含蓝色染液的DL2000加入点样孔下部。 ( 3 )电泳 打开电源开关，调节电压至3~5 V/cm(约100 V)，可见到溴酚蓝条带由负极向正极 移动，约 30-40 分钟后即可观察结果。 ( 4)观察 将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根据条带粗 细，可粗略估计该样品DNA的浓度。如同时有已知分子量的标准 DNA®行电泳，则可通过线 性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。 五、 实验结果与分析 1、 有条带跑完电泳后两边淡，中间较粗，很可能是由于点样时不均匀，两边点样较少； 2、 有条带跑完电泳后看不见，很可能是由于样品未加入点样孔，飘浮在电泳液里了 六、 思考题 做琼脂糖凝胶电泳应注意哪些问题？ 1、加样时枪头不要碰坏凝胶壁，否则 DNA的带型将不会整齐，加样前要用枪头吸打凝胶孔 中的溶液，以赶走样品空中的气泡。 2、应注意每孔最大上样容量及样品孔体积，以免加样 时样品流入附近样品孔造成交叉污染，影响结果分析。 3．配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶。 4．琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。 5．电泳时应注意电源线路，预防触电。 6．溴化乙淀具有致癌作用，配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套。并在专门的实验室 内使用。 7．紫外线对人体有损伤作用，开灯时间不宜太长，注意防护。 本文来源：https://www.wddqw.com/doc/5d699063ab956bec0975f46527d3240c8447a1e3.html