实验指导书(生理学部分)
说明：文章内容仅供预览，部分内容可能不全。下载后的文档，内容与下面显示的完全一致。下载之前请确认下面内容是否您想要的，是否完整无缺。
实验项目一：常用实验动物的基本操作 （一）实验动物的抓握、固定和处死方法 1、小鼠抓取固定方法 小鼠温顺，一般不会咬人，抓取时先用右手抓取鼠尾提起，置于鼠笼或实验台向后拉，在其向前爬行时，用左手拇指和食指抓住小鼠的两耳和颈部皮肤，将鼠体置于左手心中，把后肢拉直，以无名指按住鼠尾，小指按住后腿即可。有经验者直接用左手小指钩起鼠尾，迅速以拇指和食指、中指捏住其耳后颈背部皮肤亦可。这种在手中固定方式，能进行实验动物的灌胃、皮下、肌肉和腹腔注射以及其他实验操作。如进行解剖、手术、心脏采血和尾静脉注射时，则需将小鼠作一定形式的固定，解剖手术和心脏采血等均可使动物先取背卧位（必要时先行麻醉），再用大头针将鼠前后肢依次固定在腊板上。 2、小鼠的处死方法 可采用颈椎脱臼法。此法是将实验动物的颈椎脱臼，断离脊髓致死，为大、小鼠最常用的处死方法。操作时实验人员用右手抓住鼠尾根部并将其提起，放在鼠笼盖或其他粗糙面上，用左手拇指、食指用力向下按压鼠头及颈部，右手抓住鼠尾根部用力拉向后上方，造成颈椎脱臼，脊髓与脑干断离，实验动物立即死亡。 （二）动物血细胞计数方法 材料和用品 （1）器材：细胞计数板、细口滴管、绸布。 （2）试剂：0.4％台盼蓝。 （3）材料：血细胞悬液。 实验原理 细胞计数一般用血细胞计数板，按白细胞计数方法进行计数。 细胞计数时，先将培养细胞或血细胞稀释成细胞悬液，然后将细胞悬液滴入细胞计数板内，计数计数板上计数室四大格内的细胞数。根据计数室的容积及稀释倍数，即可计算出细胞浓度。 实验步骤： 图5－1 血细胞计数板 1．采血及稀释 用1ml移液管吸取0.38ml白细胞稀释液放入小试管内备用， 另用5ml移液管吸取3.98ml红细胞稀释液放入小试管内备用。 用酒精棉球消毒兔的耳缘静脉采血部位，用刺血针刺破血管，让血液自然流出，擦去第一滴血，待流出第二滴血时，用一次性毛细血管分2次准确吸取20ul、和20ul，将血液分 别吹入盛有白、红细胞稀释液的小试管内，用滴管放在试管底部轻轻吹出血液，用上清液冲洗毛细取血管2～3次，轻轻摇动，使液体充分混匀。 2. 血细胞计数板的结构 计数板是一块特制的长方形厚玻璃板，板面的中部有4条直槽，内侧两槽中间有一条横槽把中部隔成二长方形的平台（图5-1）。此平台比整个玻璃板的平面低0.1mm，当放上盖玻片后，平台与盖玻片之间距离（即高度）为0.1mm。平台中心部分各以3mm长，3mm宽精确划分为9个大方格，称为计数室（图5-3），每个大方格面积为1mm3，体积为0.1mm3。四角的大方格，又各分为16个中方格，适用于白细胞计数。中央的大方格则由双线划分为25个中方格，每个中方格面积为0.04mm3，体积为0.004mm3。每个中方格又各分成16个小方格，适用于红细胞计数。 将盖玻片放在计数板正中，用小吸管吸取摇匀的稀释血液，或者用洁净的玻璃棒，将一小滴血液滴在盖玻片边缘的玻片上，使稀释血液借毛细管现象而自动流入计数室内。如滴入过多，溢出并流入两侧深槽内，使盖玻片浮起，体积改变，会影响计数结果，需用滤纸片把多余的溶液吸出，以深槽内没有溶液为宜。如滴入溶液过少，经多次充液，易造成气泡，应洗净计数室，干燥后重做。红细胞和白细胞的计数，各使用一计数室。 3．计数 血液稀释液滴入计数室后，须静置2-3min，然后在低倍显微镜下计数。计数白细胞时，数四角4个大方格的白细胞总数；计数红细胞时，数中央大方格的四角的4个中方格和中央的一个中方格（共5个中方格）的红细胞总数。计数时应循一定的路径，对横跨刻度上的血细胞，依照“数上不数下，数左不数右”的原则进行计数（图5-2）。计数白细胞时，如发现各大格的白细胞数目相差8个以上；计数红细胞时，如各中方格的红细胞数目相差20个以上，表示血细胞分布不均匀，必须把稀释液摇匀后重新计数。 图5-2 血细胞计数循径示意图 4．计算 白细胞数：将4个大方格内数得白细胞总数乘以50，即得每mm3血内的白细胞总数，因为： (1)稀释液0.38ml加入血20ul，使血液稀释20倍，换算成未稀释血时应乘以20。 (2)计数四角上4个大方格内的白细胞总数，其容积为1×1×0.1×4=0.4mm3。换算成每mm3时应乘以2.5。这样把4个大方格内数得的白细胞总数乘以50（即20×2.5=50）即为每mm3血内的白细胞总数。 红细胞数：将中央大方格中的5个中方格内数得的红细胞总数乘以10，000，即得每mm3血内红细胞总数。因为： (1)稀释液3.98ml加入血20ul，使血液稀释200倍，换算成未稀释血要乘以200。 (2)在计数室内只计数0.02mm3（即1个中方格的容积为0.2×0.2×0.1=0.004mm3，5个中方格的容积为0.004×5=0.02mm3），换算成每mm3时应乘以50。 这样把5个中方格内数得的红细胞总数乘以10，000（即200×50=10，000）即得每mm3血液内的红细胞总数。 图5-3 血细胞计数板上计数室的分隔 （三）血红蛋白含量测定的方法 实验原理：实验采用的氰化高铁血红蛋白（HICN）方法是世界卫生组织（WHO）推荐为血红蛋白标准化测定的方法。血红蛋白是红细胞内带氧的色素蛋白，血红蛋白分子含有四个血红素和一个珠蛋白，血红素是一种铁金属复合物，在叶啉环结构中央有一个铁原子，血红素在分子中总量约占4%，并有血红蛋白红色。将一定量的全血与氰化高铁血红蛋白稀释液混合后，红细胞被溶解，血红蛋白释放出高铁氰化钾反应为高铁血红蛋白，再与氰化钾反应为氰化高铁血红蛋白，它是一种稳定的色素，其浓度与吸光值成正比。通过比色法就可以测定血红蛋白的含量。 实验操作步骤： 1、打开血红蛋白测定仪的电源进行预热30分钟。 2、用移液管取5ml文齐氏液放入试管中备用。 3、用酒精棉球消毒手指尖，用消过毒的一次性采血针刺破指尖，用一次性定量毛细管取血20ul。 4、将毛细取血管中的血吹入试管的稀释液中，反复2~3次，充分混匀后放置5~10分钟后备用。 5、仪器调零和校正：预热后，按下测试开关，重复三次吸入稀释液或者蒸馏水调整调零旋钮，使读数为“000”，然后校正。 按下测试开关，吸入已知标准值为100g/L的校正液，调整校正旋钮，使读数显示值与标准值相同，然后弹出测试开关。 6、测试：将吸液管浸到待测试管中的液体中，按下测试开关，吸入待测液体，读取数字，就为待测液中的血红蛋白含量。 注意： 1、吸液过程中避免吸入空气。 2、稀释液中不要出现沉淀，避免堵塞吸管。 3、测试完成后，重复吸入多次蒸馏水冲洗仪器后再关闭电源。 （四）影响血液凝固的因素 【实验目的】 本实验以发生血液凝固的时间为指标，向血液中加入或去掉某些因素或改变某些条件(如温度等)，以观察对血液凝固的影响。 【实验原理】 血液流出血管后很快就会凝固。血液凝固分为内源性凝血系统与外源性凝血系统是指在组织因子的参与下血液凝固的过程。本实验直接从动物动脉放血，由于血液几乎没有和组织因子接触，其凝血过程主要由内源性凝血系统所发动。血液凝固受许多因素的影响，凝血因子可直接影响血液凝固过程。温度、接触面的光滑程度等也可影响血液凝固过程。 【材料与方法】 （一）实验对象 家兔 （二）器材药品 小烧杯、带橡皮刷的玻棒或竹签(或小号试管刷)、清洁试管10支、秒表、水浴装置一套、冰块、棉花、石蜡油、肝素或草酸钾、生理盐水。 （三）方法与步骤 1．动物准备 家兔麻醉后，仰卧固定于兔手术台上，行一侧颈总动脉或股动脉插管，备取血用。 2．试管的准备 取8支干净的小试管，按表8-2准备各种不同的实验条件。 表8-2 影响血液凝固的因素 实 验 条 件 不加其它物质 放棉花少许 用石蜡油润滑试管内表面 保温于37C水浴糟中 冰水中 加肝素8单位 加草酸钾1-2mg 3．观察项目 (1) 取兔动脉血10ml，注入两个小烧杯内，一杯静置，另一杯用带有橡皮刷的玻棒或竹签(也可用小号试管刷)轻轻搅拌，数分钟后，玻棒或竹签上结成红色血团。用水冲洗，观察纤维蛋白形状。然后比较两杯的凝血情况。 (2) 准备好的每支试管中滴入兔血1ml，观察血液是否发生凝固及发生凝固的时间。 【实验结果】 实验结果(凝血时间) 将结果填入表8-2 【注意事项】 1．加强分工合作，记时须准确。最好由一位同学负责将血液加入试管，其它同学各掌握1-2支试管，每隔半分钟观察一次。 2．试管、注射器及小烧杯必须清洁、干燥。 3．每支试管加入的血液量要力求一致。 【要求与思考】 1．复习生理学教科书有关血液凝固的基本理论知识。 2．弄清楚血液凝固对机体的利弊关系。 3．试分析在本实验中有哪些因素可能影响实验结果？如何克服这些因素？ 【作业题】 1．肝素和草酸钾皆能抗凝，其机理一样吗？为什么？ 2．如何加速或延缓血液凝固？试阐明机理。 3．分析上述各因素影响凝固时间的机制。 4．正常人体内血液为什么不发生凝固？ 5．如何认识纤维蛋白原在凝血过程中的作用？ 实验项目二：生理信号采集系统的使用 （一）生物信号采集系统的初步使用 生物信号采集、处理系统是应用大规模集成电路、计算机硬件和软件技术开发的一种集生物信号的放大、采集、显示、处理、存储和分析的电机一体化仪器。该系统可替代传统的刺激器、放大器、示波器、记录仪，一机多用，功能强大。广泛地被应用于生理学、病理学、药理学实验。 1、计算机生物信号采、集处理系统的基本组成和工作原理 生物信号采集处理系统由硬件和软件两大部分组成。硬件主要完成对各种生物电信号(如：心电、肌电、脑电)与非电生物信号(如：血压、张力、呼吸)的采集。并对采集到的信号进行调理、放大，进而对信号进行模／数(A／D)转换，使之进入计算机。软件主要用来对已经数字化了的生物信号进行显示、记录、存储、处理及打印输出，同时对系统各部分进行控制，与操作者进行人机对话(下图)。 （1）传感器和放大器 生物所产生的信息，其形式多种多样，除生物电信号可直接检取外，其它形式的生物信 号必须先转换成电信号，对微弱的电信号还需经过放大，才能作进一步的处理。生物信号采集处理系统中的刺激器和放大器都是由计算机程控的,其工作原理和一般的刺激器、放大器完全一样。主要的区别在于一般仪器是机械触点式切换，而生物信号采集系统是电子模拟开关，由电压高低的变化控制，是程序化管理，提高了仪器的可靠性，延长了仪器的寿命。 生物信号的采集：计算机在采集生物信号时，通常按照一定的时间间隔对生物信号取样，并将其转换成数字信号后放入内存。这个过程称为采样。 与采样有关的参数包括：通道选择、采样间隔、触发方式和采样长度等方面。 ①通道选择： 一个实验往往要记录多路信号，如心电、心音、血压等。计算机对多路信号进行同步采样，是通过一个“多选一”的模拟开关完成的。在一个很短暂的时间内，计算机通过模拟开关对各路信号分别选通、采样。这样，尽管对各路信号的采样有先有后，但由于这个“时间差”极短暂，因此，仍可以认为对各路信号的采样是“同步”的。 ②采样间隔： 原始信号是连续的，而采样是间断进行的。对某一路信号而言，两个相邻采样之间的时间间隔称为采样间隔。间隔愈短，单位时间内的采样次数愈多。采样间隔的选取与生理信号的频率也有关，采样速率过低，就会使信号的高频成分丢失。但采样速率过高会产生大量不必要的数据，给处理、存储带来麻烦。根据采样定律，采样频率应大于信号最高频率的2倍。实际应用时，常取信号最高频率的3～5倍来作为采样速率。 ③采样方式： 采样通常有连续采样和触发采样两种方式。在记录自发生理信号(如心电、血压)时，采用连续采样的方式。而在记录诱发生理信号(如皮层诱发电位)时，常采用触发采样的方式。后者又可根据触发信号的来源分为外触发和内触发。 ④采样长度： 在触发采样方式中．启动采样后，采样持续的时间称为采样长度。它一般应略长于一次生理反应所持续的时间。这样既记录到了有用的波形，又不会采集太多无用的数据造成内存的浪费。 生物信号的处理： 计算机生物信号采集处理系统因其强大的计算功能，可起到滤波器的功能，而且性能远远超过模拟电路，恢复被噪音所淹没的重复性生理信号。人们可以测量信号的大小、数量、变化程度和变化规律，如波形的宽度、幅度、斜率、零交点数等参数。做进一步的分类统计、分析给出各频率分能量（如脑电、肌电及心率变异信号）在信号总能量中所占的比重、对信号源进行定位。对实验结果可以用计数或图形方式输出。对来自摄像机或扫描仪的图像信息经转换后，也可输入计算机进行分析。所以计算机生物信号采集处理系统，不仅具备了刺激器、放大器、示波器、记录仪和照相机等仪器的记录功能外，而且还兼有微分仪、积分仪、触发积分仪、频谱分析仪等信号分析仪器的信息处理功能。为节省存储空间，计算机可对其获得的数据可按一定的算法进行压缩。 动态模拟： 通过建立一定的数学模型。计算机可以仿真模拟一些生理过程。例如激素或药物在体内的分布过程、心脏的起搏过程、动作电位的产生过程等均可用计算机进行模拟。除过程模拟外，利用计算机动画技术还可在荧光屏上模拟心脏泵血、胃肠蠕动、尿液生成、兴奋的传导等生理过程。 2、计算机生物信号采集、处理系统的基本操作 掌握实验的一般流程、配置实验和刺激参数设置方法是我们用好生物信号采集系统的关键。 (1)进入系统，选择通道：确定信号输入到哪个通道，以打“对勾”表示。 (2)刺激方式的选择:根据实验的需要确定是否需要刺激。一般可有7种刺激方式可被选择。 (3)选择输入方式：根据生物信号的性质：是非电信号（如骨骼肌张力、血压、呼吸道压力、心肌收缩力、肠肌张力等）还是电的信号（如神经干动作电位、心电、神经放电、脑电等），确定是否需要换能器。 (4)交/直流的选择 根据生物信号是快信号（如神经干动作电位、心室肌动作电位、神经放电等）还是慢信号（如血压、呼吸、心电、平滑肌张力等）确定以何种电流输入。一般电信号选择交流输入，非电信号经换能后选择直流输入。来自另外的前置放大器的输入信号，采用直流输入的方式（如经微电极放大器后的心室肌动作电位信号）。可用放大器的时间常数进行选择（或有专门的开关）。 (5)放大器放大倍数的选择：采样卡的有效采样电压一般位+/-5V。所以输入信号的强度一般不能超过5 V，根据信号的强弱选择适当的放大倍数,在不溢出的前提下,放大倍数选大一些为好。 (6)滤波选择： 根据是否需要滤波确定高频滤波和时间常数，使采样在最好的波段中进行。 (7)选择显示模式 ：用计算机生物信号采集、处理系统进行实验时有两种显示模式的选择：一类为快捷（或标准）方式，系统内提供了许多常规的生理、病理、药理专项实验方法，所配置及标定的参数都已提供在每一专项实验选项中。因此只要进入系统，激活实验菜单，选择具体的实验项目，即可按照标准实验内容做好各项配置、标定而进行实验。另一类是一般性（或通用）方式，适用于科研与特殊教学实验，可根据需要不断改变系统参数（进行显示设置），使采集的波形更好，更适合于观察及符合实验结果。 (8)采样间隔选择：注意采样间隔与所采信号相匹配。采样间隔调控的合适值应多试几次，以求最好。 (9)采样 进入实验项目（通道采样内容）从1～4通道输入生理信号并选择希望进行的实验项目，点击开始按钮，系统开始采样，采样窗中即有扫描线出现，并随外部信号变化，显示起伏波形。 注意：如果在触发方式中选定了刺激器触发，则应当在主界面中点击“刺激”按钮启动刺激器，即可开始同步采样。 (10)实时调整采样参数：为使采样波形达到最好——即最有利于观察的状态，可以在采样过程中,实时调节各部分。 (11)结束采样 点击采样结束按钮结束采样，全部结果数据以图形方式显示在各自的窗口，可移动X方向棍条从头到尾观察所有的图形。并可拖选图形进行观测量、进入表格、打印等后处理。 (12) 设置存盘 如果本次实验成功，所选的设置参数合理，可将本设置以自定义文件名存盘。 3、刺激器的设置 (1)刺激的基本方式： 最基本的刺激方式有三种： ①单刺激，与普通刺激器一样，输出(数次)单个方波刺激，延时、波宽、幅度可调。可用于骨骼肌单收缩、心肌期前收缩等实验。 ②串刺激，相当于普通刺激器的复刺激，但刺激持续时间由程序控制。启动串刺激后，到达串长的时间，刺激器自动停止刺激输出。串刺激的延时（即普通复刺激的串间隔）、串长、波宽、幅度、频率可调。刺激降压神经、迷走神经和强直收缩等实验可采取此种刺激方式。 ③主周期刺激，与普通刺激器相比，此种刺激方式是将几个刺激脉冲组成一个刺激周期看待，于是有了主周期和周期数概念。主周期，每个周期所需要的时间。周期数：重复每一个周期的次数（即主周期数）。每个主周期下又有①延时、②波宽、③波幅、④波间隔、⑤脉冲数(详见刺激器部分)，这些参数都是可调的。有了这些可调参数，可输出多种刺激形式。如周期数为 1脉冲数也为1，表示重复1次主周期，主周期中只有一个脉冲，相当于单刺激。周期数是连续、脉冲数是1，即不断重复主周期，而且主周期内只有1个脉冲刺激，这相当于复刺激。周期数是连续、脉冲数是2，即不断重复主周期，而且主周期内有2个脉冲刺激，这相当于双脉冲刺激„„。 (2)专用刺激方式：为了便于实验，在上述刺激方式的基础上还可以选择下述4种刺激方式。 ①自动间隔调节：在主周期刺激基础上自动增、减脉冲间隔，默认的脉冲数为2。主要用于不应期的测量。主周期、延时、波宽、波幅、首间隔、增量可调。 ②自动幅度调节：在主周期刺激基础上自动增、减脉冲的幅度。主要用于阈强度的测定。主周期、延时、波宽、初幅度、增量、脉冲数、间隔可调。 ③自动波宽调节：在主周期刺激基础上自动增、减脉冲的波宽。主要用于时间-强度曲线的测定。主周期、延时、波幅、频率、首波宽、增量可调。 ④自动频率调节：在串刺激基础上对刺激脉冲的频率自动增、减。主要用于单收缩，强直收缩，膈肌张力与刺激频率的关系等实验。串长、波宽、波幅、首频率、增量、串间隔可调。 4、换能器定标 换能器是将非电生物信号转换为电信号的装置。由于制造时采用的部件不同及相同部件参数存在误差，所以每一个换能器在转换非生物信号时都不可能完全一致（即同样强度的能量经不同打的换能器转换的电压值不可能绝对一致）。因此，为了准确地反应实验结果，就有必要在实验前对换能器进行校验，使之尽量减少误差，保证实验结果的真实性和准确性。各种换能器标定的原理一致，仅是装置有所不同。定标包括调零和标定。 (1)调零: 选定“调零”命令之后,可使系统在输入端悬空时, 偏离基线(红色0校准线) 的直流输入信号波形回到基线位置。 (2)定标: 选定“定标”命令之后，给换能器一个固定值的标准的信号，再将其固定值输入系统，以更改原数值。今后将跟随该通道实验名称一起调用。 （二）药物对血压及心率的影响——录像 （三）蛙心起搏点观察 实验原理 心脏的特殊传导系统具有自动节律性，但各部分的自动节律性高低不同。两栖类动物的心脏起搏点是静脉窦(哺乳动物的是窦房结)。正常情况下，静脉窦（窦房结）的自律性最高，能自动产生节律性兴奋，并依次传到心房、房室交界区、心室，引起整个心脏兴奋和收缩，因此静脉窦（窦房结）是主导整个心脏兴奋和搏动的正常部位，被称为正常起搏点；其他部位的自律组织仅起着兴奋传导作用，故称之为潜在起搏点。 实验条件 蛙或蟾蜍，任氏液，蛙板，蛙类常用手术器械一套，蛙钉，玻璃分针，秒表，滴管。 实验步骤 1．暴露心脏 取蟾蜍一只，双毁髓后背位固定于蛙板上。左手持手术镊提起胸骨后方的皮肤，右手持金冠剪剪开一个小口，然后将剪刀由开口处伸入皮下，向左、右两侧下颌角方向剪开皮肤。将皮肤掀向头端，再用手术镊提起胸骨后方的腹肌，在腹肌上剪一口，将金冠剪紧贴胸壁伸入胸腔（勿伤及心脏和血管），沿皮肤切口方向剪开胸壁，剪断左右乌喙骨和锁骨，使创口呈一倒三角形。左手持眼科镊，提起心包膜。右手用眼科剪刀剪开心包膜，暴露心脏。 2．观察心脏的结构 从心脏的腹面可看到一个心室，其上方有两个心房，房室之间有房室沟。心室右上方有一动脉圆锥，是动脉根部的膨大。动脉干向上分成左右两分支。用蛙心夹夹住少许心尖部肌肉，轻轻提起蛙心夹，将心脏倒吊，可以看到心脏背面有节律搏动的静脉窦（图11-1）。在心房与静脉窦之间有一条白色半月形界线，称为窦房沟。前、后腔静脉与左、右肝静脉的血液流入静脉窦。 3．观察心搏过程仔细观察静脉窦、心房及心室收缩的顺序和频率。在主动脉干下方穿一条线，将心脏翻向头端，看准窦房沟，沿窦房沟作一结扎，称为斯氏第一结扎。观察心脏各部分搏动节律的变化，用秒表计数每分钟的搏动次数。待心房和心室恢复搏动后，计数其搏动频率。然后在房室交界处穿线，准确地结扎房室沟，称为斯氏第二结扎。待心室恢复搏动后，计数每分钟心脏各部分的搏动次数。将实验结果以表格形式列出。 4. 观察蛙类心脏收缩与电兴奋的关系 （1）打开计算机采集系统，接通张力传感器输入通道。 （2） 取一只蟾蜍，暴露心脏。用蛙心夹夹住心尖部，将蛙心夹上的系线绕过滑轮与张力传感器相连。调节滑轮位置，使心脏不离开体腔且能记录心搏曲线。调节扫描速度与心搏曲线的幅度适中。 （3）将引导心电的两个电极夹，分别夹住刺入上下肢皮下的针形电极。接通动物心电输入通道，观察心电信号。如果信号不大，可调节显示器增益，直到出现明显的心电图信号。 （4）调节两个通道的扫描速度一致。用比较显示方式，仔细观察心电图的P波与心房收缩波、QRS波群与心室收缩波在时间上的相关性。 【思考题】 根据实验结果，分析心电图相应波形早于心脏收缩及各间期的意义？ 图8-1 蟾蜍心脏背面观 （四）蛙类神经肌肉标本的制备方法 1． 双毁髓的方法 左手握蟾蜍（一般可用纱布包住蟾蜍躯干部），背部向上。用食指按压其头部前端，拇指压住躯干的背部，使头向前俯；右手持毁髓针，由两眼之间沿中线向后方划触，触及两耳后腺之间的凹陷处即是枕骨大孔的位置。将毁髓针由凹陷处垂直刺入，即可进入枕骨大孔。然后将针尖向前刺 图1-1 破坏蛙的脑和脊髓 入颅腔，在颅腔内搅动，以捣毁脑组织。如毁髓针确在颅腔内，实验者可感到针触及颅骨。此时的动物为单毁髓动物。再将毁髓针退至枕骨大孔，针尖转向后方，与脊柱平行刺入椎管，以捣毁脊髓。彻底捣毁脊髓时，可看到蟾蜍后肢突然蹬直，然后瘫软。此时的动物为双毁髓动物。如动物仍表现四肢肌肉紧张或活动自如，必须重新毁髓。 操作过程中应注意使蟾蜍头部向外侧（不要挤压耳后腺），防止耳后腺分泌物射入实验者眼内（如被射入，则立即用生理盐水冲洗眼睛）。 2．剥制后肢标本方法有两种。 (1)将双毁髓的蟾蜍背面向上放入蜡盘中。左手持手术镊轻轻提起两前肢之间背部的皮肤，右手持手术剪横向剪开皮肤，暴露耳后腺后缘水平的脊柱。用金冠剪横向剪断脊柱。左手持手术镊提起断开的脊柱后端，右手用金冠剪沿脊柱两侧剪开体壁，再剪断下腹壁肌肉，自基部剪断内脏。然后用蘸有任氏液的左手捏住断开的脊柱后端，右手向后方撕剥皮肤，同时弃其头部及内脏。将剥干净的后肢放入盛有任氏液的培养皿中。清洗手及手术器械上的污物。 (2)将双毁髓的蟾蜍腹面向上放入蜡盘中，左手持手术镊轻轻提起腹壁皮肤，右手持手术剪将皮肤剪开，再剪开腹壁肌肉。然后用手术镊轻轻提起内脏，自基部剪断（勿伤脊神经）。左手轻轻托起蟾蜍后肢，使头部及内脏向下，看清支配后肢的脊神经发出部位，于其前方剪断脊柱。剥皮的操作方法同(1)。 注意操作过程中不可将剥皮的标本同皮肤、内脏等弃物放在一起。 图1－2 剥去后肢皮肤的方法 3．分离两后肢 将去皮的后肢腹面向上置于玻璃板上，脊柱端在左侧。用左手拇指及食指压住标本的股部两侧肌肉，右手持手术刀于耻骨联合处向下按压刀刃，切开耻骨联合。然后用金冠剪剪开两后肢相连的肌肉组织，并纵向剪开脊柱（尾杆骨留在一侧），使两后肢完全分离。也可不用手术刀切开耻骨联合，而用左手托起标本，右手持金冠剪直接剪开耻骨联合。 注意：操作要十分小心，切勿剪断坐骨神经。将分开的后肢，一只继续剥制标本，另一只放入任氏液中备用。 4．分离坐骨神经 将一侧后肢的脊柱端腹面向上，趾端向外侧翻转，使其足底朝上，用固定针将标本固定在玻璃板下面的蛙板（木板或硬泡沫塑料板）上。先在腹腔面用玻璃分针沿脊柱游离坐骨神经，然后在标本的背侧于股二头肌与半膜肌的肌肉缝内将坐骨神经与周边的结缔组织分离直到腘窝，但不要伤及神经，其分支待以后用手术剪剪断。同样用玻璃分针将腓肠肌与其下的结缔组织分离并在其跟腱处穿线、结扎。 5.剪去其它不用的组织 操作从脊柱向小腿方向进行。 （1）剪去多余的脊柱和肌肉 将后肢标本腹面向上，将坐骨神经连同 2～3节脊椎用粗剪刀从脊柱上剪下来。再将标本背面向上，用镊子轻轻提起脊椎，自上而下剪去支配腓肠肌以外的神经分支，直至腘窝，并搭放在腓肠肌上。沿膝关节剪去股骨周围的肌肉，并将股骨刮净，用粗剪刀剪去股骨上端的1/3（保留2/3），制成坐骨神经-小腿的标本。 图1－3 （2）完成坐骨神经腓肠肌标本 将脊椎和坐骨神经从腓肠肌上取下，提起腓肠肌的结扎线剪断跟腱。用粗剪剪去膝关节以下部位，便制成了坐骨神经-腓肠肌标本。 6.检验标本 用沾有任氏液的锌铜弓触及一下（或电刺激刺激）坐骨神经或用鑷子夹持坐骨神经中枢端,如腓肠肌发生迅速而明显的收缩，说明标本的兴奋性良好。标本浸入盛有任氏液的培养皿中备用。 然后再依次用热玻棒、食盐（或1% H2SO4滤纸）刺激坐骨神经中枢端（或肌肉），观察肌肉收缩有何变化? 如果放上食盐肌肉无动静,用任氏液将盐冲洗掉,再观察冲洗过程中肌肉收缩有何变化? （五）神经干电位的测定方法 1、坐骨神经标本的制备 制做方法基本同于坐骨神经-腓肠肌标本的制备（见前面内容），但无需保留股骨和腓肠肌。坐骨神经干要求尽可能长些。在脊椎附近将神经主干结扎，剪断。提起线头剪去神经干的所有分支和结缔组织，到达腘窝后，可继续分离出腓神经或胫神经，在靠近趾部剪断神经。将制备好的神经标本浸泡在任氏液中数分钟，待其兴奋性稳定后开始实验。 图1－4 蛙后肢的肌肉分布 2、仪器及标本的连结 （1）用浸有任氏液的棉球擦拭神经标本屏蔽盒上的电极，标本盒内放置一块湿润的滤纸片，以防标本干燥。用滤纸片吸去标本上过多的任氏液，将其平搭在屏蔽盒的刺激电极、接地电极和引导电极上，并且使其近中端置于刺激电极上，远中端置于引导电极上。 （2）使用计算机生物信号采集处理系统进行实验，参照图5-2连接仪器。两对记录电极分别连接到CH1、CH2通道，刺激电极连接到刺激输出。打开计算机，启动生物信号采集处理系统，进入“神经干动作电位”模拟实验菜单。 3、观测和测定双相动作电位 （1） 调节刺激强度，观察动作电位波形的变化。读出波宽为某一数值时的阈刺激和最大刺激。 （2）仔细观察双相动作电位的波形。读出最大刺激时双相动作电位上下相的振幅和整个动作电位持续时间数值。 （3）将神经干标本放置的方向倒换后，双相动作电位的波形有无变化？ （4）将两根引导电极r1,r1’的位置调换，动作电位波形有和变化？ 4、观察单相动作电位 用镊子将两个引导电极r1,r1’之间的神经夹伤，或用一小块浸有3 mol/L KCl溶液的滤纸片贴在第二个引导电极(r1’)处的神经干上，再刺激时呈现的即是单相动作电位。读出最大刺激时单相动作电位的振幅值和整个动作电位持续的时间数值。 5、动作电位传导速度的测定 换一根坐骨神经，按步骤2（1）搭放在神经屏蔽盒的电极上。进入“神经干动作电位传导速度”模拟实验菜单。 给予神经干最大刺激强度，可在两个通道中（或示波器的上、下线）观察到先后形成的两个双向动作电位波形。 (1)分别测量从刺激伪迹到两个动作电位起始点的时间，设上线为t1，下线为t2(或可直接测量两个动作电位起点的间隔时间)，求出t2～t1的时间差值。 (2)测量标本屏蔽盒中两对引导电极相应的电极之间的距离d(即测定r1～r2的间距)。 (3) 将神经干标本置于4℃的任氏液中浸泡5 min后，再测定神经冲动的传导速度。 本文来源：https://www.wddqw.com/doc/64bd6d05677d27284b73f242336c1eb91a373332.html