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　　姓 名：
　　导师姓名：
　　研究方向： 病理生理学
　　论文题目： 血清TLR4及肠型脂肪酸结合蛋白在NEC早期制造中的临床意义
　　院(系)：
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　　开题时间：
　　一、立论依据
　　(包括研究意义、美洲外研究现状情况，并附主要参考文献及出处)
　　对人体研究，着重结合国际科学发展趋势，论述本课题的科学意义;
　　对应用人体研究，着重结合学科前沿、围绕医学发展和社会发展中的重要科技问题，论述其应用情景。
　　(一) 研究意义：
　　新生儿坏死性小肠结肠炎(NEC)是新生儿时期严重威胁生命的消化系统急症，以早产儿、小于胎龄儿发病者较多，在NICU患儿中的发病率高达10%，是早产儿死亡的重要原因之一。临床以腹胀、腹泻、黏液血便和胆汁样呕吐为主要表现，腹部X线平片以肠壁囊样积气为特征，肠道病变范围可局限或广泛，回肠累及最多，黏膜呈凝固性坏死，粘膜下层弥漫性出血或坏死，严重者肠壁全层坏死甚至穿孔。
　　目前有很多实验用于制造NEC。除了可以根据临床表现制造外，腹部X线片是最常用的辅助检查实验，虽然其用于制造NEC的特异度较高，但对于早期制造NEC帮助不大，目前也有很多关于IL-8、IL-10、IL-1受体拮抗剂等生化指标用于制造NEC的研究，但缺乏较好的用于早期制造NEC的血生化指标。
　　TLR是由Nomuria等在哺乳动物体内实验与果蝇Toll蛋白相似的一种蛋白。TLR在不同细胞的表达和识别不同细胞因子在多种疾病的发病机制中起重要作用，目前研究实验TLR参与肿瘤、肠道免疫性疾病等多种疾病的发病。在人类体内实验的TLR家族共有10个成员，其中TLR4是近年来研究较多的其中一个，TLR4主要表达在内皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞及DC上。
　　I-FABP是由小肠单层柱状上皮细胞分泌的一种小分子蛋白质，占成熟的细胞基质蛋白的2%。肠缺血早期仅有黏膜受累时即可因为细胞通透性升高而导致IFABP释放入血，具有较好的器官特异性。
　　本研究旨在通过检测NEC患儿血清中的TLR4及肠型脂肪酸结合蛋白，监测其在NEC中的动态变化，作为NEC严重程度的生化指标，可为辅助制造NEC提供依据，达到早期干预的目的。
　　(二)美洲外研究现状情况：
　　1、TLR4上调导致NEC发生的机制研究
　　1)、与LPS结合后，被激活的TLR4可以通过髓样分化因子88(MyD88)依赖性和非依赖性两个途径介导炎症因子的释放。其中MyD88依赖性途径主要介导NF-kB活化和细胞因子产生，而MyD88的非依赖性途径主要诱导LPS的干扰素(IFN)，以及干扰素诱导蛋白10(IP10)基因、糖皮质激素衰减反应基因16(GARG-16)、干扰素调节基因1(IRG-1)的表达和DC的成熟，激活下游NF-kB、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)p38信号通路，诱导促炎症因子如白细胞介素-1(IL-1)6、12和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等的表达。
　　2)、Chan等研究实验，TLR4激活后能影响肠道粘膜的修复能力，此与其减少肠道细胞增殖、降低内皮细胞基底部粘附力及减少内皮细胞移动到受损位置的数量有关。Sodhi等研究证明，TLR4通过抑制细胞的增殖分化作用于wnt-β-5信号系统，使肠道粘膜修复能力受损，加重NEC的病理变化。
　　3)、美国研究表明，TLR4不仅可以与LPS结合诱导炎症反应、损伤肠道粘膜导致NEC发生，许多分子蛋白如纤维结合蛋白、透明质酸。硫酸肝素等均能激活TLR4，在无外来病原菌时TLR4表达可能增高，释放大量炎症因子从而发生NEC的炎症瀑布链式反应。这一实验，可以体现一些无明显感染因素引起的NEC。
　　2、细菌及其产物如何引起肠上皮细胞的损伤探讨
　　血小板活化因子(PAF)在NEC的发生中起重要作用。有研究应用缺氧、低温、人工喂养、细菌感染等实验制成了NEC的动物模型，结果实验肠上皮的PAF及其受体的表达增高，阻断PAF的受体表达后NEC的发生率明显下降。PAF表达增高可使肠壁血管通透性增高、白细胞游出、细胞粘附分子的合成增多及活性氧生成增加，从而损伤肠壁。有研究表明，PAF可活化肠上皮细胞的STAT，使磷酯酶A2及内皮素一1的合成增加，并可通过上bax的表达而诱导肠上皮细胞凋亡，从而损伤肠上皮细胞、破坏细胞问的连接而引起细菌移位。另外，PAF还可诱导肠上皮细胞产生TLR4，后者可活化IKK，从而激活NFxB而引起炎症级联反应。如果敲除TLR4，则NEC的发生率明显降低，说明TLR4在NEC的发生中也有重要作用。
　　3、沈涤华等研究表明I—FABP可以作为早期肠缺血较理想的生物学指标，国外学者研究实验NEC患儿血清I-FABP水平明显升高，且与NCE严重程度有关。
　　4、 Thuijls等研究实验重症NEC患儿在早期血I-FABP水平即明显升高。当临床出
　　现轻度腹胀，大便隐血阳性怀疑NEC时，血、尿I—FABP水平在发展成为重症NEC的患儿
　　会明显高于制造为其他疾病和病情稳定在NECI期或Ⅱ期的患儿。
　　主要参考文献
　　1、 Hans Van Goudoever，陈超，张蓉.新生儿坏死性小肠结肠炎的热点问题.中国循证儿科杂志 2011，06(5).
　　2、 邹静静，陈运彬.TOLL样受体在新生儿坏死性小肠结肠炎中的表达及作用.中国新生儿科杂志 2012,27(5).
　　3、 李志杰，刘靖华，姜勇.ToLL样受体的实验及其研究进展.中国危重病急救医学，2003,15:694-697.
　　4、 Viriyakosol S,Tobias PS,Kitchens RL,et al..MD-2 binds to bacterial lipopolysaccharide.J Biol Chem，2001,276:38044-38051.
　　5、 Johnson GB, Bruun GJ,Kodaira Y,et al.Receptor-mediated monitoring of tissue well-being via detection of soluble heparin s　　ulfate by Toll-like receptor4.J Immunol，2002,168:5233-5239.
　　6、 Gribar SC,Sodhi CP,Richardson WM,et al.Reciprocal expression and signalingof TLR4 and TLR9 in the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis.J Immunol，2009,182:636-646.
　　7、 冯杰雄.美国新生儿坏死性小肠结肠炎研究现状.中华小儿外科杂志.2006，27(7).
　　8、 沈涤华，施诚仁，吴燕，等.肠脂肪酸结合蛋白(I-FABP)在肠缺血早期制造的意义[J].中华小儿外科杂志，2004，25(2)：176—179.
　　(可续页)
　　二、研究方案
　　1.研究目标、研究内容和拟解决的关键问题
　　NEC分三期：
　　一期为可疑病例，有非特异性症状，此时患儿体温不稳定，嗜睡、呼吸暂停，胃肠道症状包括吃奶差、胃潴留、呕吐、轻微腹胀，腹部X线平片可以正常或肠扩张。
　　二期为确诊病例;
　　三期为重症病例，死亡率高。
　　研究目标：
　　通过检测血清TLR4及肠型脂肪酸结合蛋白(I-FABP)水平，探寻两者在早期制造新生儿坏死性小肠结肠炎(NEC)中的价值。
　　研究内容：
　　实验分组o
　　实验组：共二组
　　早期NEC组：NEC一期患儿
　　晚期NEC组：NEC二期患儿、NEC三期患儿。
　　对照组：正常新生儿
　　所选病例均为早产儿
　　各组研究对象均空腹采血(时机：纳入实验组后24小时内)。o
　　对照组于出生后1—5 d内抽血检查。o
　　o　　 标本：使用不含热原和内毒素的试管，室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
　　用ELISA实验测定血清中TLR4及肠型脂肪酸结合蛋白水平。o
　　试剂盒：上海裕平生物科技有限公司生产的人Toll样受体4(TLR4)ELISA试剂盒和I-FABP试剂盒。o
　　对比检测结果，观察实验组中各期患儿TLR4及肠型脂肪酸结合蛋白水平，与对照组进行比较。
　　拟解决的关键问题：
　　通过本研究观察早期NEC组和晚期NEC组TLR4及肠型脂肪酸结合蛋白水平，各期间TLR4及肠型脂肪酸结合蛋白水平是否存在差异。
　　2.拟采取的研究实验、技术路线、实验方案及可行性情况
　　研究实验：
　　采用病例对照研究实验情况TLR4和肠型脂肪酸结合蛋白在NEC患儿血清中的浓度变化，探讨二者与NEC的关系。
　　统计学情况：
　　采用SPSSl6.0统计软件。o
　　正态分布的计量资料采用数据以均数±标准差表示, 组间比较采用单项方差情况，两两比较应用LSD法;o
　　非正态分布计量资料采用中位数(四分位间距)(M(Q))表示，组间比较采用秩和检验;o
　　计数资料采用构成比表示，统计学情况采用χ2检验或Fisher精确检验o
　　血清TLR4及肠型脂肪酸结合蛋白(I-FABP)水平与NEC严重程度的相关性情况采用spearman相关情况o
　　po　　<0.05表示差异有统计学意义
　　技术路线：
　　选取合适的实验组和对照组→采集血标本→进行试验→整理数据→数据统计情况
　　→撰写论文
　　3. 本课题的创新之处
　　通过研究，探索性实验能早期制造NEC的较敏感的生化指标，为制造提供依据 。
　　4、研究计划及预测进展
　　2012年6月-2013年2月，阅读文献，论证课题可行性，并报经医院伦理委员会通过
　　2013年2月-2014年2月，标本采集;
　　2014年3月，试验阶段;
　　2014年3月-2014年5月，完成科研论文。
　　4. 预期研究成果
　　NEC患儿血清中的TLR4及肠型脂肪酸结合蛋白水平与严重程度呈正相关。
　　三、研究人体
　　1.与本课题有关的，前期研究工作积累和已取得的研究工作成绩
　　1)本人从事新生儿科工作，对NEC较为常见，病例易得到。
　　2)前期已采集大量的血标本。
　　3)已阅读大量的相关文献，为研究工作打好人体。
　　2.已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径(包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况)
　　1)血标本易采集，
　　2)试验条件已达到，
　　3)试剂盒易购买，
　　4)试验条件已达到。
　　3.近期已发表与本课题有关的主要论著目录
　　1、陆妹 朱小瑜 刘登礼 陆亚东 •新生儿坏死性小肠结肠炎危险因素临床情况•中国新生儿科杂志•
　　2012•27(6) •382
　　2、李粹 任雪云 蔡文仙 牛峰海•细胞因子及肠脂肪酸结合蛋白在新生儿坏死性小肠结肠炎早期制造中的价值探讨•山东医药•2013•53(14)•50
　　3、秦嘉丽 韦红 李禄全 王佚•血清肠型脂肪酸结合蛋白在制造新生儿坏死性小肠结肠炎中的意义•
　　中华小儿外科杂志•2013•34(8)•590
　　4、许笑南 何少茹 郑曼利 •新生儿坏死性小肠结肠炎各期危险因素差异情况•中华实用儿科临床杂志•2013•28(19) •1483
　　*论文：作者•题目•刊名•年份•卷(期)•页码
　　专著：作者•书名•出版者•年份
　　四、经费预算
　　支出科目 金额
　　(万元) 计算根据及理由
　　1.合计
　　注:预算支出科目按下列顺序填写：1.科研业务费2.实验材料费3.仪器设备费4. 协作费 5. 研究组织实施费

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