小白鼠染色体标本的制作、染色与观察 姓名： 学号： 实验时间： 1.实验目的 1初步掌握小鼠睾丸细胞染色体标本的基本制作过程和Giemsa染色法,了解各操作步骤的原理; 2了解常用实验动物染色体的数目及特点; 3认识不同生物染色体的特征; 2.实验原理 凡处于活跃增殖状态或者经过各种处理,任何动物组织的细胞都可进入分裂时期,均可用于染色体分析;在正常动物体内,精巢和骨髓均为是活跃分裂的组织;给动物注射一定剂量的秋水仙素,即可使许多处于分裂的细胞停滞于中期,然后采用常规空气干燥法制备染色体,即可得到大量可分析的染色体标本;本方法简便、可靠,不需要经体外培养和无菌操作,易于推广;骨髓细胞是用于动物细胞遗传学研究很好的材料;但在取材方面,精巢又比骨髓要简易一些,故本实验选用小鼠的精巢为实验材料; 对于小鼠精巢染色体标本的制作,一般包括以下几个要点：①用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成,使细胞分裂停滞在中期, 使中期染色体停留在赤道面处；②用低渗法使细胞膨胀, 以至于在滴片时细胞胀破, 使细胞的染色体铺展到载玻片上；③空气干燥法可使细胞的染色体在载片上展平,经Giemsa染色后便可观察到染色体的显微图象; Giemsa染色是最常用的染色方法之一,适用于多种细胞和染色体染色;主要用Giemsa染液可以将细胞核染成紫红色或蓝紫色,胞浆染成粉红色,在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像; 3.实验材料和用品 1材料：小白鼠 2试剂：秋水仙素、生理盐水%的NaCl溶液、%KCl低渗溶液、固定液甲醇：冰醋酸=3：1、Giemsa染液 3器材：解剖盘、解剖镊、解剖剪、小烧杯×2、吸管、玻璃刻度离心管、恒温水浴锅、离心机、铜网、预冷载玻片、记号笔、普通光学显微镜、玻璃等 4.实验步骤 1小白鼠染色体标本制作 ①取雄性小鼠以每克体重4μｇ注射秋水仙素,经14～16小时后,断头法杀死小鼠,取出睾丸用生理盐水%的NaCl洗去血污; ②放入装有1ml %KCl液的小烧杯中剪碎至呈乳白色; ③用铜网过滤到刻度离心管中,再加%KCl液至4ml; ④37℃静置30分钟,进行低渗处理; ⑤以800～1000转/分离心8分钟; ⑥弃上清液,加入2ml甲醇·冰醋酸固定液3：1,并用吸管至管底吹气,轻轻打散细胞,固定8分钟; ⑦再以800～1000转/分离心8分钟; ⑧弃上清液,加1ml固定液,再制成细胞悬液,固定5分钟; ⑨取洁净的低温预冷载片,距载片10～15cm高度滴下2～3滴细胞悬液,从载片一边向另一边轻轻吹气,并同时轻轻敲打载片,以使细胞均匀分布和促使染色体展开; ⑩用滤纸擦去载片上多余液体,空气干燥或成文火干燥; 2小白鼠染色体标本染色与观察 ①倒置染色法——在玻璃板上用废旧载玻片作支架,使标本载玻片的标本面向下放置到支架上,在玻璃板和标本载玻片之间滴加Giemsa染液;目的一可以节省染料,二可以避免染液快速挥发,三可以防止染色颗粒沉淀,影响观察;在操作时应注意,多个样品同时染色应摆放紧密,不要有间隙；滴染液时应尽量慢,不要有气泡,以免部分染色体不被着色; ②用 Giemsa染色20 ～ 30分钟,细水冲洗玻片背面,去多余染液,气干; ③镜检：低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相,高倍镜或油镜下观察染色体形态并计数; 5.实验结果 此图是经秋水仙素处理的小鼠精细胞染色体标本照片,数数发现有36条染色体而非40条,可能是应为染色体重叠程度太高而造成计量误差; 视野中可见大量的精子,它们有一个比较圆的头部和鞭毛,还有一些细胞有一个尖,那是未变形的精子;部分细胞处于减数第一次分裂中期,这样的细胞是二倍体,应有40条染色体；有些处于减数第二次分裂中期,这样的细胞是单倍体,应有20条染色体;还有一些细胞处于分裂期,但不是中期,这类细胞染色体的凝集程度不是很高,呈丝状;处于减数分裂中期的染色体染色质凝缩程度达到最大;小鼠的染色体多为端着丝粒染色体,呈“V”字形或“U”字形,染色体呈短棒状; 6.讨论与结论 1向小鼠腹腔注射秋水仙素时,用左手抓住小鼠背部的皮,右手持注射器,进针时倾斜45°,在开始注射前,将针头略向上挑,以免将秋水仙素注入小鼠的肠道内;注射过程中注意观察小鼠的反应;如果秋水仙素被正确注入腹腔内,小鼠应该是很安静的; 2断头法处死小鼠后,血液要冲洗干净,以免影响实验观察; 3从开始加入%KCl低渗溶液第一次离心前,时间最好控制在50-60min;过滤出来的如果不是乳白色悬浊液就再过滤一次; 4两次离心的转速控制在800～1000转/分,不要太高,以免破碎细胞;第一次离心去上清液加固定液时时不要过分吹打,第二次离心后要充分将细胞吹开; 5滴片时,使滴管与载玻片间的距离尽量远,这样细胞才能被“摔碎”,这一点十分重要,从实验结果看来,低渗使细胞破碎效果并不佳,通过摔碎细胞,让染色体更容易辨认,否则,细胞整个将成蓝色圆状,而膜内物质看不清; 6滴完片之后,将载玻片的一端轻轻在试验台边缘敲打,使未破碎的细胞破碎; 7边敲打载玻片边从载玻片一边向另一边轻轻吹气,以使细胞均匀分布和促使染色体展开; 8多个样品同时进行染色时,载玻片应摆放紧密,不要有间隙；滴染液时应尽量慢,不要有气泡,以免部分染色体不被着色;染色时间30分钟左右; 9冲洗载玻片时从背面冲洗; 本文来源：https://www.wddqw.com/doc/3c9a3864ac45b307e87101f69e3143323868f566.html