第八章测序和诱变 第一节DNA测序 一、基本策略:双脱氧核苷酸链终止法;高分辨率凝胶分辨相差1Nt的DNA片段。 1、双脱氧法:利用DNA多聚酶的二个基本性质:能以DNA为模板准确地合成互补的DNA 链;能利用2?,3?-双脱氧核苷酸为底物。 2、链终止法:双脱氧核苷酸,用量恰当时,使得链在各位点终止的比例恰当;每当双脱氧核苷酸加入合成的链中时,合成被终止:对每一种碱基: A, T, C, and G ,需要一个合成反应 3、序列的分离:高分辨胶电泳:(1)分离被终止的链;(2)需要分辨一个碱基的长度差异:可见不同片段的差异(3)凝胶电泳:很薄的胶V ery thin gel、高的电压High voltage、用放射性或荧光标记 二、测序步骤1.模板制备:单链、双链;2.聚合反应:单链模板55C退火、37C聚合10分钟。模板、引物、dNTP、ddNTP、聚合酶、缓冲液;3.片段分离;4.片段的显示 1.测序模板比较:①除去盐、其它抑制DNA聚合酶的小分子;②清除小核酸片段③M13载体:单链,DNA较纯;能得到很好的测序结果;但只能测一条链;④PCR产物:最大长度一般2-3kb; ⑤质粒:要进行碱变性、中和、引物配对步骤,可用Taq酶进行循环测序。插入片段长度可达10kb。 三测序用的DNA聚合酶: (一)酶的种类1、Klenow酶(Sanger等,1977),2、反转录酶3经过修饰消除了3?→5?外节酶活性的T7噬菌体DNA聚合酶4、测序酶2.0 (Sequenase)5、及从嗜热水生菌(T'hermus aquaticus)分离的耐热DNA聚合物(Taq DNA聚合酶)。 (二)1、聚合反应用的酶及其问题:5?-3?外切酶会切引物;Klenow 酶和天然的Taq酶会依赖于序列区分单脱氧和双脱氧核苷酸、使得各条带强度(合成的DNA量)不同;Taq酶在不同的ddNTP掺入效率不同。 2、解决方法:定向诱变天然酶,用T7DNA聚合酶(测序酶);耐热测序酶; (三)酶的介绍1、焦磷酸酶:(1)针对问题:测序中用的DNA聚合酶还能以较低的速度催化聚合反应的逆反应:DNA链的3?端和焦磷酸反应、水解下末端的一个核苷酸、产生dNTP,这种反应在聚合反应时间长的时候不可忽视,其影响合成长片段带的强度 (2)解决方法:可提高dNTP浓度、用焦磷酸酶水解焦磷酸消除 2、Klenow酶:最初用以建立Sanger法的酶。至今仍然广泛用于DNA序列测定的酶。 1)持续合成能力低,因为聚合酸人模板上随机解离而终止合成,因而导致背景增高。得到大约250-350个核苷酸的序列。2)这种酶对模板中的同聚核苷酸段或其他含牢固二级结构的区域进行复制的效能很低。 3、测序酶(SequenaseTM):1)测序酶(SequenaseTM):一种经过化学修饰的T7噬菌体DNA 聚合酶。①完全缺失了3…→5?外切核酸酶活性,②极其稳定、活性要比经化学修饰的测序酶高2倍③测序酶持续合成能力很强③聚合速率很高⑤对诸如dITP和7-脱氮-dGTP等用于提高分子辨率使测序凝胶某些区段上的压缩条带得以分开的核苷酸类似物具有广泛的耐受性。3它是测定长段DNA序列的首选酶。一套反应常常就可以测定数百个核苷酸的DNA序列---序列的长度更多是受聚丙烯酰胺凝胶的分辨能力而不是受该聚合酶的特性所制约。 3、Taq DNA聚合酶:1)适用于由于二级结构导致读出条带模糊不清时。-Taq DNA聚合酶在70-75℃活性最高,这一温度下即使GC丰富的模板也无法形成二级结构。2)这种酶的持续合成能力甚佳。3)测序用普通Taq酶的缺点(用遗传工程升级版AmpliTaq等)-ddNTP掺入速度比dNTP慢两个数量级;-ddNTP掺入受模板DNA序列影响;-条带强度不同,从底到顶减弱;-遇到12个或更多的单核苷酸重复时无法准确合成---polymerase slippage. 四、AmpliTaq CS等的循环测序:1、无5?-3?外切酶活性、提高了ddNTP掺入比例 2、不对称PCR+双脱氧链终止法 3、可选择标记引物(多数)或内部标记 4、15-40次循环 5、单、双链模板均可 6、模板量可少(<50fm) 五、放射性标记的dNTP : 1、32P发射的强β粒子1)由于散射,放射自显影片上的条带远比凝胶上的DNA条带更宽、 更为扩散,---制约从单一凝胶上能读出的核苷酸序列的正确性和长度。2)32P的衰变会引起样品中DNA的辐射分解-----测序结果保存时间不能超过一两天,否则DNA将被严重破坏以至测序凝胶上模糊不清、真假莫辨。 本文来源：https://www.wddqw.com/doc/99bc91ffea7101f69e3143323968011ca200f7a0.html