实验三 多管发酵法检测水中的大肠菌群 （一） 实验目的 1. 了解饮用水和水源水大肠菌群的原理和意义 2．学习检测水中大肠菌群的方法 （二）实验原理 大肠菌群是评价水质好坏的一个重要的卫生指标，也是反映水体被生活污水污染的一项重要监测项目。 大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌（Escherichia coli）为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37℃生长时，能在48小时内发酵乳糖并产酸产气。我国生活饮用水卫生标准中规定一升水样中总大肠菌群数不超过三个。 多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。 1．初发酵试验 水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。48小时后仍不产气的为阴性结果。 2．平板分离 初发酵管24至48小时内产酸产气的均需在复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基，Endo′s medium）或伊红美蓝琼脂（eosin methylene blue agar,EMB agar）平板上划线分离菌落。 3．复发酵试验 以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。 （二） 实验器材 1. 水样 自来水 2．试剂 乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管），伊红美蓝或复红亚硫酸钠琼脂平板，革兰氏染液。 3． 仪器及其它用品 载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭菌试管，革兰氏染液，显微镜，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，灭菌三角瓶等。 （四） 实验方法 1． 水样的采取 水源水 2．初发酵试验 取16支发酵管，其中10支用移液管加入10ml一倍的乳酸蛋白胨培养液，5支加入5ml三倍乳糖蛋白胨培养液，1支加入9ml自然水。完成后包装好，于121℃高压灭菌锅中灭菌30min左右。冷却后，在无菌操作条件下，向装有三倍的乳酸蛋白胨培养液的5支试管加入10ml水样，向装有一倍的乳糖蛋白胨培养液的5支试管中加入1ml水样，向装有一倍的乳 酸蛋白胨培养液的另5支试管中加入1ml 10水样。 将各试管充分混均，置于37℃恒温箱中培养24h。 （2）平板分离 经24小时培养后，将产酸产气及48小时产酸产气的发酵管（瓶）液体，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再置于37℃下培养18—24小时，将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。 （a）深紫黑色、有金属光泽。（b）紫黑色、不带或略带金属光泽。（c）淡紫红色、中心颜色较深。 （3）复发酵试验 经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1—3个，37℃培养24小时，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管（瓶）数查表，即得大肠菌群数。 -1 表1 大肠杆菌群的最可能数（MPN单位：个·（100ml） -1出现阳性份数 10ml 管 1ml 管 0.1ml 管 每100ml水样中细菌的最可能数 95%可信限度值 下限 上限 出现阳性份数 10ml 管 1ml 管 0.1ml 管 每100ml水样中细菌的最可能数 95%可信限度值 下限 上限 0 0 0 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 0 0 1 2 0 0 1 1 2 0 0 1 1 2 3 0 0 1 1 2 2 3 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 <2 2 2 4 2 4 4 6 6 5 7 7 9 9 12 8 11 11 14 14 17 17 13 17 17 每100ml <0.5 <0.5 <0.5 <0.5 <0.5 <0.5 <0.5 <0.5 <0.5 1 1 2 2 3 1 2 2 4 4 5 5 3 5 5 7 7 11 7 11 11 15 15 13 `17 17 21 21 28 19 25 25 34 34 46 46 31 46 46 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2 3 3 4 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 4 4 5 5 5 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 3 0 1 2 3 4 0 1 2 26 27 33 34 23 34 43 33 46 63 49 70 94 79 110 140 180 130 170 220 280 350 240 350 540 每100ml9 9 11 12 7 11 15 11 16 21 17 23 28 25 31 37 44 35 43 57 90 120 68 120 180 出现阳性份数 95%可信限度值 出现阳性份数 78 80 93 93 70 89 110 93 120 150 130 170 220 190 250 310 500 300 190 700 850 1000 750 1000 1400 95%可信限度值 10ml 管 1ml 管 0.1ml 管 水样中细菌的最可能数 下限 上限 10ml 管 1ml 管 0.1ml 管 水样中细菌的最可能数 下限 上限 4 4 4 1 1 2 1 2 0 21 26 22 7 9 7 63 78 67 5 5 5 5 5 5 3 4 5 920 300 1600 640 ≧2400 3200 5800 水样总量：55.5ml(5管10ml水样，5管0.1ml水样，5管0.1 1:10稀释水样时，不同阳性和阴性情况下100ml水样中细菌的最可能数和95%可信限度值) （五）实验结果 1．查表1得每升水源水样中大肠菌群数是多少？ 出现阳性份数 10ml 管 1ml 管 0.1ml 管 （六） 思考题 1．为什么要选择大肠菌群作为水源被肠道病原菌污染的指示菌？ 本文来源：https://www.wddqw.com/doc/f91bfc322179168884868762caaedd3383c4b5bf.html