三代基因组测序技术简介及其原理整理 第一代测序技术 第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格(Sanger)和考尔森(Coulson)开创的链终止法以及1976-1977年由马克西姆(Maxam)和吉尔伯特(Gilbert)发明的化学法(链降解)。 1977年,桑格测定了第一个基因组序列——噬菌体X174,全长5375个碱基。自此,人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力,并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年,完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。 Sanger法原理: 1)在模板指导下,DNA聚合酶不断将dNTP(N=A/G/T/ C)加到引物的3’- OH末端,合成出新的互补链。在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP,在互补链在DNA聚合酶作用下延伸时,一旦连接上ddNTP,由于双脱氧核糖的2’和3’都不含羟基,故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键而终止反应,随即形成一系列不同长度的、以同样引物为起始、以同一碱基终止的短片段混合物。 2)双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA,从而读取DNA核苷酸序列。 化学裂解法原理: 与Sanger法类似,将DNA模板分成4个反应。在每个反应中,先在模板5’端进行放射性标记,再加入能特异性在其中一种碱基处切开DNA的化学试剂。反应进行时,平均一个DNA分子只在随机位点产生一次裂解。接着,通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。 第二代测序技术 第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp,准确性高达99.999%,但其测序成本高,通量低等方面的缺点,严重影响了其真正大规模的应用。因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。经过不断的技术开发和改进,以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa,Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。第二代测序技术大大降低了测序成本的同时,还大幅提高了测序速度,并且保持了高准确性,以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间,而使用二代测序技术则仅仅需要1周,但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多。 Roche 454 Roche 454测序系统是第一个商业化运营二代测序技术的平台。它的主要测序原理是: (1)DNA文库制备 454测序系统的文件构建方式和illumina的不同,它是利用喷雾法将待测DNA打断成300-800bp长的小片段,并在片段两端加上不同的接头,或将待测DNA变性后用杂交引物进 行PCR扩增,连接载体,构建单链DNA文库。 (2)Emulsion PCR (乳液PCR,其实是一个注水到油的独特过程) 454当然DNA扩增过程也和illumina的截然不同,它将这些单链DNA结合在水油包被的直径约28um的磁珠上,并在其上面孵育、退火。 乳液PCR最大的特点是可以形成数目庞大的独立反应空间以进行DNA扩增。其关键技术是“注水到油”(水包油),基本过程是在PCR反应前,将包含PCR所有反应成分的水溶液注入到高速旋转的矿物油表面,水溶液瞬间形成无数个被矿物油包裹的小水滴。这些小水滴就构成了独立的PCR反应空间。理想状态下,每个小水滴只含一个DNA模板和一个磁珠。 这些被小水滴包被的磁珠表面含有与接头互补的DNA序列,因此这些单链DNA序列能够特异地结合在磁珠上。同时孵育体系中含有PCR反应试剂,所以保证了每个与磁珠结合的小片段都能独立进行PCR扩增,并且扩增产物仍可以结合到磁珠上。当反应完成后,可以破坏孵育体系并将带有DNA的磁珠富集下来。进过扩增,每个小片段都将被扩增约100万倍,从而达到下一步测序所要求的DNA量。 (3)焦磷酸测序 测序前需要先用一种聚合酶和单链结合蛋白处理带有DNA的磁珠,接着将磁珠放在一种PTP平板上。这种平板上特制有许多直径约为44um的小孔,每个小孔仅能容纳一个磁珠,通过这种方法来固定每个磁珠的位置,以便检测接下来的测序反应过程。 测序方法采用焦磷酸测序法,将一种比PTP板上小孔直径更小的磁珠放入小孔中,启动测序反应。测序反应以磁珠上大量扩增出的单链DNA为模板,每次反应加入一种dNTP进行合成反应。如果dNTP能与待测序列配对,则会在合成后释放焦磷酸基团。释放的焦磷酸基团会与反应体系中的ATP硫酸化学酶反应生成ATP。生成的ATP和荧光素酶共同氧化使测序反应中的荧光素分子并发出荧光,同时由PTP板另一侧的CCD照相机记录,最后通过计算机进行光信号处理而获得最终的测序结果。 由于每一种dNTP在反应中产生的荧光颜色不同,因此可以根据荧光的颜色来判断被测分子的序列。反应结束后,游离的dNTP会在双磷酸酶的作用下降解ATP,从而导致荧光淬灭,以便使测序反应进入下一个循环。由于454测序技术中,每个测序反应都在PTP板上独立的小孔中进行,因而能大大降低相互间的干扰和测序偏差。 本文来源：https://www.wddqw.com/doc/665fb6e6a56e58fafab069dc5022aaea988f41ce.html