愈创木酚法测定过氧化物酶活性 一、实验目的 过氧化物酶它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在 植物生长发育过程中，它的活性可以反映某一时期植物体内代谢的变化。通过 本实验了解过氧化物酶的作用，掌握愈创木酚法测定过氧化物酶。 二、实验原理 在过氧化物酶（POD催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产 物在 470nm 处有最大光吸收值，故可通过测 470nm 下的吸光度变化测定过氧 化物酶的活性。 三、实验材料 马铃薯块茎。 四、设备与试剂 分光光度计，离心机，研钵，容量瓶，量筒，试管，吸管。 0.05 mol L的磷酸缓冲液（pH 5.5）; 0.05 mol L愈创木酚溶液；2% H2O2; 20％三氯乙酸 五、实验步骤 （一） 酶液的制备 取1.0〜5.0 g洗净去皮的马铃薯块茎，切碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓 冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中，于 定容至刻度，低温下保存备用。 （二） 过氧化物酶活性测定 酶活性测定的反应体系： 3000Xg离心10 min，上清液 转入25 mL容量瓶中。沉淀用5 mL磷酸缓冲液再提取两次，上清液并入容量瓶 中，1/ 2 依次加入 2.9 mL 0.05 molL-1 磷酸缓冲液；1.0 mL2% H2O2; 1.0 mL 0.05 mol •-l愈创木酚和0.1 mL酶液。用加热煮沸5 min的酶液为对照，反应体系加 入酶液后，立即于34C水浴中保温3 min,然后迅速稀释1倍，470 nm波长下 比色，每隔1 min记录1次吸光度A470，共记录5次，然后以每分钟内A470变 化 0.01 为 1 个酶活性单位（ U）。 六、实验结果 以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（U）。 △ A470 X VT 过氧化物酶活性（Ug-1min-1）= ---------------- WX VSX 0.01 X t 式中： △ A470――反应时间内吸光度的变化； W ----- 马铃薯鲜重（g）; t ----- 反应时间（min）； VT――提取酶液总体积（mL）; VS---- 测定时取用酶液体积（mL）。 七、注意事项 酶液的的提取过程要尽量在低温温条件下进行。 H2O2要在反应开始前加，不能直接加入。 2/ 2 本文来源：https://www.wddqw.com/doc/dc2a19e7ad45b307e87101f69e3143323868f558.html