细胞色素P450 BM-3热稳定性的半理性改造刘晓萌;张彭湃;胡升;黄俊;梅乐和;姚善泾;金志华;雷引林;王进波 【期刊名称】《高校化学工程学报》 【年(卷),期】2015(000)005 【摘 要】P450 BM-3 fromBacillus megaterium is a self-sufficient fusion protein and its thermostability was enhanced by semi-rational molecular engineering in this study. An amino acid residue site G46 which may significantly influence thermostability was identified from parent enzyme P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q/D422G) with the help of B-FITTER software. A mutant P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q//D422G/G46S) with better thermostability and higher hydroxylation activity towards indole was obtained through site-directed saturation mutagenesis and screening. The half inactivation (T5010) temperature of the mutant enzyme was 5℃ higher than that of the parent enzyme, and its half-life (t1/2)under 50℃was more than doubled. Kinetic analysis indicates that the mutant enzyme withKm of 0.43 mmol×L-1 exhibits higher affinity and catalytic activity for substrates than the parent enzyme withKm of 0.55 mmol×L-1. Thekcat of the mutant enzyme is 28.99 min-1 which is almost two times that of the parent enzyme. The catalytic efficiency (kcat/Km) of the mutant is enhanced by 1.48 fold. Moreover, this study may serve as the basis for further elucidation of substrate activation mechanism of P450 BM-3.%为了提高细胞色素单加氧酶P450 BM-3的热稳定性，采用半理性设计策略对该酶进行了分子改造。首先采用B-FITTER软件分析了P450 BM-3晶体结构中各氨基酸残基位点的温度因子(B- factor)，识别出了一个对酶的热稳定性有不利影响的关键氨基酸残基位点G46，然后以P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q/D422G)为亲本酶在该位点进行定点饱和突变构建了突变文库，并从饱和突变文库中筛选获得了一个热稳定性得到显著提高的突变酶 P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q/D422G/G46S)。该突变酶(G46S)的半失活温度(T5010)比亲本酶提高了5℃(达到48℃；在50℃的半衰期t1/2比亲本酶延长了一倍。同时，突变酶的酶学性质也得到明显改善，与亲本相比，突变酶Km降低了22％， kcat提高了90%，催化效率kcat/Km(67.42 L×(mmol×min)-1)比亲本提高了1.48倍。这说明G46位点不仅影响酶的热稳定性，还影响酶对底物的结合与催化性能。G46S突变酶的获得表明，只要采用适当的半理性设计策略对正确的位点进行分子改造，可以在提高酶的热稳定性的同时，保持或甚至提高酶的催化活性。 【总页数】7页(P1138-1144) 【作 者】刘晓萌;张彭湃;胡升;黄俊;梅乐和;姚善泾;金志华;雷引林;王进波 【作者单位】浙江大学化学工程与生物工程学院，浙江杭州 310027;浙江大学化学工程与生物工程学院，浙江杭州 310027;浙江大学宁波理工学院生物与化学工程学院，浙江宁波 315100;浙江科技学院生物与化学工程学院，浙江杭州 310023;浙江大学化学工程与生物工程学院，浙江杭州 310027; 浙江大学宁波理工学院生物与化学工程学院，浙江宁波 315100;浙江大学化学工程与生物工程学院，浙江杭州 310027;浙江大学宁波理工学院生物与化学工程学院，浙江宁波 315100;浙江大学宁波理工学院生物与化学工程学院，浙江宁波 315100;浙江大学宁波理工学院生物与化学工程学院，浙江宁波 315100 【正文语种】中 文 【中图分类】TQ962.2 【相关文献】 1.饱和突变定向进化细胞色素P450 BM-3 [J], 李红梅;梅乐和;URLACHER;V;B;SCHMID;R;D 2.氨基酸突变对细胞色素P450 BM-3羟基化吲哚能力的影响 [J], 李红梅;梅乐和;高舜晔 3.一个有利于细胞色素P450 BM-3催化吲哚合成靛蓝的三位点突变酶:D168L/E435T/V445A [J], 张彭湃;胡升;梅乐和;雷引林;金志华;姚善泾 4.定点突变提高细胞色素P450 BM-3吲哚羟基化能力 [J], 张彭湃;胡升;黄俊;梅乐和;雷引林;金志华;姚善泾 5.细胞色素P450 BM-3羟基化吲哚能力的半理性改造 [J], 胡升;虞青;梅乐和;姚善泾;金志华 因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买 本文来源：https://www.wddqw.com/doc/89a83e2c1dd9ad51f01dc281e53a580216fc50b9.html